目的:骨肉瘤是最常见的恶性原发性骨组织肿瘤之一。并且常常好发于儿童和青少年的长骨的干骺端。最初诊断初期就有部分患者出现转移。骨肉瘤具有高度侵袭和高度转移等特性,会引起肺转移和进行性骨质破坏。目前在临床上骨肉瘤的治疗主要以手术切除为主,联合化疗或放疗。尽管在过去的几十年里骨肉瘤的治疗效果得到了适当的改善,但骨肉瘤患者的5年总体生存率仍然相对较低。根治性手术的术中污染,以及无法完全清除的肿瘤周围组织中的微病变以及微残留肿瘤是骨肉瘤患者局部复发的主要原因。因此,迫切需要新的治疗方法,以控制术中肿瘤的污染和残留,降低复发率,提高患者的生存率。低温等离子体已经在很多研究中被证实具有对多种体外培养的肿瘤细胞增殖产生抑制以及能够促进肿瘤细胞凋亡的作用。另外低温等离子体激活介质如等离子体激活液是通过使用低温等离子体刺激不同类型的溶液物质,让溶液中产生出多种生物活性物质的一种活性液体。这些激活液具有方便转运及较大的渗透性等优点,另外大量的体外实验表面,低温等离子体激活液同样对肿瘤细胞有良好的增殖抑制及促进凋亡的效果,且对正常的组织细胞毒副作用较小。本课题的研究是通过利用空气源低温等离子体装置,介导并激活林格氏液制备低温等离子体激活液,并利用此活性液体研究低温等离子体活化林格氏液对骨肉瘤细胞MG63和U2OS的影响,并探讨其可能的作用机理。方法:使用自助研发的利用空气源的低温等离子体装置,分别辐照林格氏液,并且其处理时间为60s、120s、180s、240s、300s来制备低温等离子体活化林格氏液。然后使用低温等离子体活化林格氏液接触并处理体外培养的骨肉瘤MG63、U2OS细胞株,并在光学显微镜下观察细胞形态变化情况。利用MTT法检测低温等离子体活化林格氏液的不同组间及不同时间点时骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和人成骨细胞株h FOB1.19细胞存活率情况。人成骨细胞h FOB1.19被作为正常对照组,MTT法评估等离子体激活林格氏液对骨肉瘤及人成骨细胞的选择性作用。同时利用Annexin-V和PI染色剂试剂盒染色后再使用流式细胞仪器测细胞凋亡情况。应用Western blot法检测凋亡蛋白caspase3、cleaved caspase3、细胞色素c和PARP的表达情况。最后利用JC-1染色法检测肿瘤细胞线粒体膜电位变化情况,同时利用DCFH-DA对细胞内活性氧(ROS)的水平进行检测验证。结果:在使用低温等离子体激活林格氏液处理细胞数小时后观察到细胞形态的皱缩以及核固缩。通过利用MTT法检测细胞存活率发现低温等离子体活化林格氏液对骨肉瘤细胞系MG63和U2OS的存在明显的增殖抑制作用,其增殖抑制作用具有剂量依赖性及时间依赖性。同时通过与人成骨细胞h FOB1.19的对比,发现这种作用具有选择性。通过利用Annexin-V/PI染色法检测到凋亡率的增加发现低温等离子体活化林格氏液对骨肉瘤细胞系MG63存在明显的促凋亡作用,另外通过利用Western blot法验证了细胞内凋亡蛋白caspase3、cleaved caspase3及PARP表达的变化与细胞凋亡时凋亡蛋白变化相一致。通过利用JC-1染色剂检测细胞线粒体膜电位发现线粒体膜电位在细胞凋亡早期发生了下降现象,Western blot法检测发现在细胞凋亡早期,细胞色素c从线粒体中释放到细胞浆中。并且我们发现随着等离子体激活林格氏液剂量的增加,检测到骨肉瘤细胞内ROS的增加,但随着曝光时间的延长,细胞内ROS的含量相对于对照组出现了增高。结论:低温等离子体活化林格氏液可以选择性的抑制体外培养的骨肉瘤细胞增殖,其增殖抑制的原因是低温等离子体活化林格氏也可以诱导骨肉瘤细胞凋亡。这种诱发骨肉瘤细胞凋亡的作用可能是通过增高细胞内活性氧水平,进一步诱导线粒体膜电位水平的下降和线粒体内细胞色素c向细胞质中的释放,从而促使细胞凋亡的级联反应。