论文部分内容阅读
背景与目的:非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种胰岛素抵抗和遗传易感性相关代谢应激性肝损伤,疾病谱包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）及其相关肝硬化。代谢性炎症是NAFLD发病与进展的基础,而大量证据表明库普弗细胞（KC）在代谢性炎症及NAFLD的病程进展中发挥至关重要的作用。脂多糖（LPS）/内毒素可诱导KC的经典激活。肝细胞发生脂肪变性后,通过损伤相关分子模式与KCs表面Toll样受体4（TLR4）结合引起KCs的经典激活,激活的KCs释放大量的TNF-α及IL-6等炎性因子,加重肝细胞脂肪变及肝细胞损伤,其中TNF-α还可通过自分泌的方式对KCs进行自我激活。KCs在NAFLD肝脂肪变及NASH发生、进展及肝纤维化中均起重要作用。因此,寻找可能的内源性KCs功能调控分子,对了解代谢性炎症的发病机理、单纯性脂肪肝进展为NASH及NASH不断进展的原因、寻找可能的治疗靶标,均有重要作用。甘丙肽是参与食欲及能量代谢调节的内源性物质。甘丙肽是由29个氨基酸残基组成的多肽,即往有研究表明其可能还参与局部炎症调控甘丙肽在肝脏内表达,其在肝内的生理功能研究较少。我们早期研究发现高脂饮食诱导的大鼠肝脂肪变和NASH发生过程中,伴随循环中甘丙肽水平由升高至正常的动态变化,其水平还与单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等炎症因子密切相关。进一步动物学研究证实外源性甘丙肽注射可抑制CD68阳性细胞在NASH小鼠模型中的聚集,但未能缓解肝脂肪变与肝细胞气球样变,其作用机制不明,我们推测甘丙肽可能直接影响肝内巨噬细胞或KCs功能。目前尚未见甘丙肽参与NASH发生时KCs功能调控的报道。同时,甘丙肽作为机体能量代谢的重要调控因子,我们推测其可能通过影响连接能量代谢与炎症反应的信号通路或关键蛋白,来影响炎症细胞功能与炎症反应。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是目前发现的重要的能量代谢与炎症信号双重调控的重要蛋白。最新发现的关于AMPK在炎症和免疫中的作用支持了代谢在炎症中的作用,AMPK的激活导致NF-κB的激活减少,和被诸如LPS的激活的巨噬细胞中TNF-α减少。因此,甘丙肽可能通过影响能量代谢,激活AMPK信号通路,通过AMPK信号通路影响巨噬细胞功能,进一步达到抑制炎症的作用。本课题将对以上研究假设加以证实,为甘丙肽与NASH关系提供新的实验依据。方法:小鼠RAW264.7和J774A.1巨噬细胞体外培养,分别分为空白对照组、LPS对照组、甘丙肽处理组。LPS组和甘丙肽处理组细胞均给予LPS（1μg/ml）刺激2h,使细胞激活,后甘丙肽组另加入不同浓度的甘丙肽（250nmol/L、500nmol/L、1000nmol/L）继续处理24h后,镜下观察各组细胞形态变化;使用CCK-8试剂盒检测各组细胞增殖情况变化;使用荧光定量PCR检测各组细胞炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表达变化;使用Latex Beads乳胶微球吞噬实验检测各组细胞吞噬功能,计数视野内200个细胞中吞噬2个及以上颗粒的细胞比例作为吞噬能力;采用DCFH-DA（50μmol/L）作探针,经流式细胞仪检测ROS水平;使用Transwell法检测细胞趋化功能,每孔随机取5个视野,趋化结果以高倍视野下（×400）的趋化指数表示;提取各组蛋白,使用Western blot法检测各组诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）和精氨酸酶1（Arg1）蛋白表达水平;提取各组细胞蛋白,经Western Blot检测各组AMPKα、pAMPKα,ACC及pACC的表达水平;提取各组RNA,半定量RT-PCR法检测甘丙肽受体GalR1、GalR2和GalR3在各组中的表达。结果:小鼠RAW264.7巨噬细胞:LPS处理组IL-6、IL-1β和TNF-αmRNA水平分别较对照组升高（7083±432.5）倍、（3106±104.3）倍和（108.0±47.58）倍,而1000nmol/L甘丙肽处理组三者表达水平较LPS组分别下降55.16%、23.71%和95.10%（P<0.05）;Latex Beads吞噬实验分析结果显示,LPS组巨噬细胞吞噬能力为（96±2.17）%,而使用甘丙肽进行混合处理后,不同浓度甘丙肽（250nmol/L、500nmol/L、1000nmol/L）吞噬能力较LPS组降低35.73%、38.63%和50.36%（P<0.05）;流式细胞仪检测细胞内活性氧自由基结果显示,不同浓度甘丙肽处理组较LPS组活性氧自由基产生降低18.22%、19.17%、21.35%（P<0.05）;Transwell检测结果显示,不同浓度甘丙肽（250nmol/L、500nmol/L、1000nmol/L）处理组较LPS组巨噬细胞趋化能力降低55.93%、57.14%、71.42%（P<0.05）;Western blot分析结果显示,iNOS蛋白在LPS组较空白对照组升高（19.5±1.964）倍,Arg1蛋白水平在LPS组较空白对照组降低62.18%,而给予1000nmol/L甘丙肽混合处理后,iNOS蛋白水平较LPS组降低41.63%,Arg1蛋白较LPS组升高（2.31±0.12）倍（P<0.05）;逆转录-PCR结果显示,在未处理的细胞和LPS处理组以及LPS和甘丙肽（1000nmol/L）处理的细胞中均有甘丙肽2型受体（GalR2）及3型受体（GalR3）表达。小鼠J774A.1巨噬细胞:Latex Beads吞噬实验分析结果显示,LPS组巨噬细胞吞噬能力为（90±1.35）%,而使用不同浓度甘丙肽（250nmol/L、500nmol/L、1000nmol/L）进行混合处理后,吞噬能力较LPS组降低41.73%、45.33%、49.78%（P<0.05）;流式细胞仪检测细胞内活性氧自由基结果显示,甘丙肽处理组较LPS组活性氧自由基产生降低58.47%、43.26%、55.13%（P<0.05）;Western blot分析结果显示,LPS组iNOS蛋白表达较对照组升高（1.7±0.13）倍（P<0.05）,在给予甘丙肽（500nmol/L、1000nmol/L）混合处理后,iNOS蛋白水平较LPS组分别降低约49.17%和55.36%,而1000nmol/L甘丙肽处理组Arg1蛋白水平较LPS组升高约（1.49±0.12）倍,与LPS组比差异有统计学意义（P<0.05）。Western blot分析结果显示,在小鼠RAW264.7中,在LPS诱导激活巨噬细胞后,加入甘丙肽（250nmol/L、500nmol/L、1000nmol/L）处理后,均可见pAMPKαThr172激活,AMPK通路下游靶蛋白pACCser79均可见激活,在J774A.1巨噬细胞中,甘丙肽处理组（500nmol/L、1000nmol/L）均可见pAMPKαThr172激活,AMPK通路下游靶蛋白pACCser79在使用1000nmol/L甘丙肽处理时可见明显激活。较未处理组及LPS组相比,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:甘丙肽降低LPS诱导的小鼠巨噬细胞炎症因子的表达,抑制巨噬细胞吞噬和趋化功能、减少细胞内活性氧自由基的产生,从而抑制小鼠巨噬细胞的促炎表型,这一抗炎作用可能是通过细胞表面的甘丙肽受体介导,并激活AMPK信号通路来实现。