马度米星是一种聚醚类离子载体抗球虫药,用作家禽饲料添加剂。马度米星在畜禽体内安全范围较窄,常因使用不当导致死亡,带来巨大经济损失;另外由于被误食或残留在动物性食品中而引起食用者中毒甚至死亡,严重威胁人类健康。马度米星毒性主要表现为心肌和骨骼肌损伤。本课题组前期研究发现,马度米星可提高骨骼肌细胞活性氧水平,抑制PP5从而激活JNK,诱导细胞凋亡。马度米星还可抑制Akt并阻断自噬流,导致骨骼肌成肌细胞中自噬体累积进而凋亡。为进一步探讨马度米星对骨骼肌的毒性及其机制,本研究借助体外C2C12和L6骨骼肌成肌细胞培养和体内ICR小鼠和黄羽肉鸡饲养模型,通过马度米星和/或地高辛处理,检测细胞活力、细胞内ATP含量、pH值、钙离子浓度、线粒体膜电位及AMPK、钠钾ATP酶、内质网应激和自噬相关蛋白表达,研究马度米星抑制骨骼肌细胞生长机制,理解马度米星对小鼠和肉鸡骨骼肌毒性作用机理,为预防和治疗马度米星中毒提供理论依据。在骨骼肌成肌细胞体外试验中,0.2～1.0 μM马度米星处理C2C12和L6细胞24～72 h,MTT法检测细胞活力,利用试剂盒测定细胞内ATP含量,通过荧光探针标记结合流式细胞术检测细胞内钙离子浓度、pH值和线粒体膜电位,Western blotting检测AMPK、钠钾ATP酶以及内质网应激和自噬相关蛋白表达;另外,在马度米星联合地高辛处理试验中,分为空白对照组、10.0 μM地高辛处理组、1.0 μM马度米星处理组和10.0 μM地高辛+1.0 μM马度米星共处理组,MTT法检测细胞活力,Western blotting检测钠钾ATP酶和自噬相关蛋白表达。结果表明,0.2～1.0 μM马度米星能够抑制C2C12和L6细胞活力,升高胞内ATP、pH值和钙离子浓度,降低线粒体膜电位并上调内质网应激和自噬相关蛋白表达;地高辛和马度米星共处理组与马度米星处理组相比,钠钾ATP酶、LC3B-Ⅱ和p62蛋白表达水平降低,细胞活力降低。在小鼠体内试验中,将20～25 g雄性ICR小鼠分为空白对照组、1.75 mg/kg b.w.马度米星组和3.50 mg/kg b.w.马度米星组,马度米星灌胃7天后取股直肌,Western blotting检测AMPK、钠钾ATP酶及内质网应激和自噬相关蛋白表达。结果表明,马度米星处理组小鼠股直肌组织中 p-AMPK(Thr183/Thr172)、p-eIF2α(Ser51)、ATF4、CHOP、钠钾ATP酶、LC3B-Ⅱ和p62蛋白表达均上调。1.75 mg/kg b.w.马度米星组分别为对照组的 1.44、1.61、1.35、2.58、1.41、3.79、2.10 倍;3.50 mg/kg b.w.马度米星组则分别为 1.71、2.99、1.61、3.34、4.01、7.05、9.18 倍。在肉鸡体内试验中,将28日龄雄性黄羽肉鸡分为空白对照组、0.1 mg马度米星组、0.2 mg马度米星组和0.5 mg马度米星组。灌胃给予马度米星14天,取股直肌通过 Western blotting 检测 p-AMPK(Thr183/Thr172)、p-eIF2α(Ser51)、LC3B、p62和钠钾ATP酶表达量。结果表明,马度米星组肉鸡股直肌组织中p-AMPK(Thr183/Thr172)、p-eIF2α(Ser51)、钠钾 ATP 酶、LC3B-Ⅱ 和 p62 蛋白表达量均高于对照组。0.1 mg马度米星组分别达到对照组的1.47、1.25、1.29、1.52、2.03倍;0.2 mg马度米星组分别为1.97、1.83、1.83、2.00、3.50倍;0.5 mg马度米星组则为3.02、2.37、3.08、3.54、12.59 倍。综上所述,马度米星能够抑制骨骼肌成肌细胞活力,扰乱细胞内能量代谢以及离子平衡,破坏细胞内环境稳态;马度米星可激活骨骼肌细胞中AMPK并诱导内质网应激;钠钾ATP酶介导马度米星对骨骼肌细胞中自噬流的抑制作用。