【摘 要】
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目的:利用siRNA干扰技术干扰不均一核糖核蛋白A2/B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1,hnRNPA2/B1)基因,探讨hnRNPA2/B1基因对宫颈癌细胞自噬的影响及其可能机制。方法:(1)设计3条si-HnRNP A2/B1序列,瞬时转染人宫颈癌Hela与Siha细胞,利用实时荧光定量PCR(reverse transcripti
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目的:利用siRNA干扰技术干扰不均一核糖核蛋白A2/B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1,hnRNPA2/B1)基因,探讨hnRNPA2/B1基因对宫颈癌细胞自噬的影响及其可能机制。方法:(1)设计3条si-HnRNP A2/B1序列,瞬时转染人宫颈癌Hela与Siha细胞,利用实时荧光定量PCR(reverse transcription-quantitative PCR,RT-qPCR)和Western blot验证并挑选出干扰效率最佳的1条siRNA干扰序列进行后续实验,将每株细胞分为si-NC组和si-HnRNP A2/B1组;(2)在透射电镜(TEM)下观察各组细胞自噬小体形成情况;(3)运用Western blot检测各组细胞自噬相关蛋白LC3II/I、Beclin1、p62蛋白表达水平;(4)联合运用自噬抑制剂氯喹抑制各组细胞自噬溶酶体融合,通过Western blot检测各组细胞自噬相关蛋白LC3II/I、P62蛋白表达变化,实验分为4组(si-NC组、si-NC+CQ组、si-1组、si-1+CQ组);(5)运用MTT法检测联合运用自噬抑制剂氯喹对各组细胞增殖的影响,设氯喹浓度为20uM、40uM、80uM、160uM、320uM;(6)运用Western blot检测各组细胞自噬相关通路mTOR、ERK的相关蛋白表达情况。结果:(1)RT-qPCR结果显示,与si-NC组相比,si1-HnRNP A2/B1组的干扰效率最好,在Hela和Siha细胞中的干扰效率分别达(80.11±11.51)%、(65.29±7.05)%(P<0.05),Western blot结果也显示si1-HnRNP A2/B1组的干扰效率最好,因此后续实验选用si1-HnRNP A2/B1序列。(2)透射电镜观察显示,在Hela与Siha细胞中,与si-NC组相比,si-1组细胞中自噬小体明显减少。(3)Western blot结果显示,在Hela细胞与Siha细胞中,与si-NC组相比,si-1组中LC3II/I、Beclin1、P62表达水平均降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)运用自噬抑制剂氯喹后,与si-NC组和si-1组相比,si-NC+CQ组与si-1+CQ组LC3II/I、P62蛋白水平均升高,证明氯喹抑制了自噬体与溶酶体融合,LC3II/I、P62蛋白不能通过自噬途径进行降解。同时,在Hela与Siha细胞中,与si-NC+CQ组相比,si-1+CQ组细胞中的LC3II/I、P62蛋白水平降低(P<0.05),进一步证明了敲低HnRNP A2/B1基因抑制了宫颈癌细胞的自噬。(5)MTT结果显示当氯喹浓度为20uM、40uM、80uM时,氯喹对Hela及Siha细胞的增殖没有明显抑制作用,各组细胞的存活率没有显著差异;当氯喹浓度大于或等于160uM时,对各组细胞增殖均出现抑制作用,且对实验组增殖抑制更明显(P<0.05)。(6)在宫颈癌Hela与Siha细胞中,与si-NC组比较,si-1组p-ERK/ERK明显降低(P<0.05),p-mTOR/mTOR无明显差异。结论:在宫颈癌细胞中沉默HnRNP A2/B1基因可抑制宫颈癌细胞自噬;CQ能够抑制宫颈癌细胞增殖,沉默HnRNP A2/B1基因可增强其抑制作用;HnRNP A2/B1基因可能通过ERK调控宫颈癌细胞自噬。
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