论文部分内容阅读
免疫失衡和紊乱在严重感染性疾病和脓毒症发病过程中至关重要。共刺激分子及其网络在免疫应答的有效启动、适度效应和适时中止过程中起着极其重要的调节作用。共刺激分子及其配体均以受体和配体相互作用的形式介导信号,受体和配体通常表达在不同细胞上。受体和配体通常一个持续性表达,一个诱导性表达。在不同的免疫应答阶段,这些分子以一定的程序各自独特而又相互关联的方式参与信号,共同调控机体的免疫应答。共刺激分子存在膜型和可溶性两种形式,表达于细胞膜上和分泌于体液中,参与共刺激信号的介导和自身调节。正性共刺激信号和负性共抑制信号的失衡直接影响着机体的免疫监视与免疫耐受状态,进而参与肿瘤、自身免疫病和感染等疾病的发生。B7家族属于免疫球蛋白超家族,是最早被证实的T细胞活化共刺激分子,其受体为T细胞表面的CD28家族。B7家族分子与CD28家族成员结合提供共刺激或共抑制信号,是迄今为止公认的最基本的协同刺激信号。与B7-H3是B7家族的新成员,已有研究结果表明其在肿瘤和感染性疾病中有一定价值,但其在儿童阑尾炎中的表达和临床意义目前知之甚少。急性阑尾炎（Acute Appendicitis,AA）不仅仅是儿童最常见的外科急诊手术,还是儿童急性腹腔感染最主要的病因。腹腔感染是仅次于肺部的脓毒症第二来源,外科手术合并脓毒症的患者中66%可检测到腹腔内感染灶。另有研究显示腹腔感染占ICU中所有感染病人的19.6%,而且腹腔感染的死亡率高于其他部位感染者。本研究通过分析共刺激分子B7-H3在儿童急性阑尾炎和儿童急性阑尾炎合并穿孔中的表达特征及其临床意义,对不同实验室指标在预测急性阑尾炎以及预测急性阑尾炎合并穿孔的效能进行综合评价。评估可溶性B7H3分子（soluble B7-H3,sB7H3）作为儿童急性阑尾炎生物标记物的临床价值,并进行了阑尾炎的B7-H3组织表达特征和外周血中sB7H3和TNF-α的相关性分析。第一部分 共刺激分子B7-H3在儿童急性阑尾炎的临床研究目的:研究sB7H3与其他实验室指标在儿童急性阑尾炎外周血中的表达特征,结合临床资料,对这些指标在儿童急性阑尾炎预测效能进行综合评价。方法:选择2015年4月至2015年10月于苏州大学附属儿童医院普外科实施阑尾切除术,并经术后组织病理学证实的AA患儿92例。根据术后的组织病理学分为单纯性阑尾炎组（Simple Appendicitis,SA）12例、化脓性阑尾炎组（Purulent Appendicitis,PA）49 例和坏疽性阑尾炎组（Gangrenous Appendicitis,GA）31 例。同时选择90例无呼吸道症状和腹部疼痛,年龄和性别相匹配的非急诊腹股沟疝儿童作为对照组（Control Group,CG）。收集各组外周血,用于血常规、C反应蛋白（C-Reactive Protein,CRP）、生化全套、凝血常规和sB7H3检测。结合临床表现和病理结果对上述指标进行综合分析。通过受试者工作特征曲线（Receiver Operating Characteristic Curve,ROC）评估这些标记物的诊断效率,并确定这些标记物的临界值和ROC曲线下面积（Area Under the ROC Curve,AUC）。结果:（1）AA组的指标水平,包括白细胞（White Blood Cell,WBC）、CRP、总胆红素（Total Bilirubin,Tbil）、间接胆红素（Indirect Bilirubin,Ibil）、直接胆红素（Direct Bilirubin,Dbil）、纤维蛋白原（Fibrinogen,FIB）和sB7H3水平,均显着高于对照组（P＜0.05）;而且上述指标在SA,PA和GA组间呈依次上升趋势。（2）然而,上述指标中只有CRP,FIB和sB7H3水平在不同AA组（SA,PA和GA）间的差异有统计学意义（P＜0.05）。此外,CRP和FIB水平在SA组和PA组的组间差异无统计学意义（P＞0.05）。（3）AA组的平均血小板体积（Mean Platelet Volume,MPV）、血小板分布宽度（Platelet Distribution Width,PDW）和碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase,ALP）水平与对照组间的差异有统计学意义。（4）AA组和对照组比较时,预测效能较高（0.9＜AUC）≤1)的指标为sB7H3（1）和CRP（0.983）。中等预测效能的（0.7＜AUC≤0.9）指标是 WBC（0.895）,Dbil（0.874）,FIB（0.845）,Tbil（0.831）,PDW（0.776）,Ibil（0.772）,平均红细胞体积（Mean Corpuscular Volume,MCV）（0.724）和红细胞分布宽度（Red Blood Cell Distribution Width,RDW）（0.711）。低预测效能的（AUC≤0.7）的指标是血小板计数（Platelet,PLT）（0.302）,ALP（0.302）和 MPV（0.119）。结论:sB7H3和CRP对儿童AA具有很高的预测效能。胆红素、FIB和PDW升高有助于提示AA。sB7H3是本研究中唯一与AA病理类型统计学相关的生物标记物。第二部分共刺激分子B7-H3在儿童急性阑尾炎合并穿孔的临床研究目的:研究sB7H3与其他实验室指标在儿童急性阑尾炎外周血中的表达特征,结合临床资料,对这些指标预测儿童急性阑尾炎合并穿孔的效能进行综合评价。方法:同期AA患儿92例。根据术中所见,分为非穿孔型阑尾炎组71例和穿孔型阑尾炎组21例。将其各项临床及实验室指标依次进行多因素logistic回归分析和ROC曲线分析。结果:（1）92例AA患儿,21例合并穿孔,穿孔率为22.82%。（2）对照组和SA组未发现穿孔病例;21例穿孔病理结果其中6例为PA,15例为GA。（3）多元logistic回归分析的结果表明,非穿孔性阑尾炎组和穿孔性阑尾炎组之间只有 CRP（t=-3.475,P=0.002）和 sB7H3（t=-2.309,P=0.023）有统计学差异。（4）进一步的ROC曲线分析发现CRP和sB7H3的AUC值分别为0.734（CRP的临界值=67.005mg/L,敏感度0.714,特异度0.747）和0.675（sB7H3的临界值=48.033ng/ml,敏感度 0.524,特异度 0.859）。（5）sB7H3和CRP的组合下,相应的临界值分别sB7H3 48.033ng/ml和CRP 67.005mg/L 时,AUC 为 0.735。（6）各年龄组间的穿孔率差异无统计学意义（Z=-0.041,P=0.967）,但呈现年龄越小穿孔率明显增高的趋势。结论:CRP能用于临床预测儿童AA合并穿孔,但其诊断性能并不高;尚不能表明sB7H3能预测儿童急性阑尾炎合并穿孔。不同年龄组间的穿孔率无显著性差异,但呈现年龄越小穿孔率越高的趋势。第三部分 B7-H3在儿童急性阑尾炎的组织表达特征及sB7H3与TNF-α的相关性分析研究目的:探讨共刺激分子B7-H3在儿童急性阑尾炎发生发展中的的组织表达模式及sB7H3与TNF-α在儿童急性阑尾炎的相关性。方法:选择10例正常阑尾组织、10例单纯性阑尾炎阑尾组织、10例化脓性阑尾炎阑尾组织和10例坏疽性阑尾炎阑尾组织;通过免疫组化方法检测B7-H3分子,分析B7-H3在不同病理类型组织中的表达程度。选择同期AA患儿92例（SA 12例、PA 49例和GA 31例）和CG患儿90例。AA组患儿分为单纯性阑尾炎组（12例）和复杂性阑尾炎组（PA49例+GA31例）。收集外周血血浆,分别检测各组血浆中的sB7H3和肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）水平。比较不同组间的sB7H3水平,并做sB7H3和TNF-α的相关性分析。结果:（1）正常阑尾、单纯性阑尾炎、化脓性阑尾炎和坏疽性阑尾炎组中均可检测到B7-H3表达;四种不同阶段阑尾组织病理B7-H3表达程度评分逐渐增加,且有显著性差异（F=5.261,P=0.041）。（2）AA患儿sB7H3水平和TNF-α水平均显著高于CG（P＜0.001）。（3）sB7H3和TNF-α水平在SA组、PA组和GA组之间均呈逐次上升趋势。sB7H3水平在SA组、PA组和GA组之间的差异有统计学意义（P＜0.001）,而TNF-α水平在SA组、PA组和GA组之间的差异没有统计学意义（P＞0.05）。（4）AA患儿的sB7H3和TNF-α水平呈正相关（y=1.3x+9.85,R2=0.087,P＜0.001）;SA、PA和GA组患儿的sB7H3和TNF-α 水平均无相关性（P＞0.05）。（5）sB7H3 用于区分 AA 和 CG 时,临界值为 17.850ng/ml,AUC 为 1.0;sB7H3 用于诊断SA和复杂AA时,临界值为36.146ng/ml,AUC为0.916;sB7H3用于区分PA组和GA组时,临界值34.950ng/ml,AUC为0.748。结论:共刺激分子B7-H3可能在阑尾炎进展中扮演重要作用。儿童急性阑尾炎sB7H3水平可能与和TNF-α有关。sB7H3预测儿童AA和复杂AA方面具有较高的效能,预测GA具有中等效能。sB7H3是预测儿童AA的良好生物标记物。第四部分 B7-H3在盲肠结扎穿孔脓毒症小鼠模型的表达特征目的:探索sB7H3在盲肠结扎穿孔脓毒症小鼠血清的表达特征。方法:通过盲肠结扎穿孔法建立脓毒症小鼠模型,50只健康昆明小鼠随机（随机数字法）分为五组:盲肠结扎穿孔术组（术后12小时组、术后24小时组和术后48小时组）,假手术组和正常对照组,每组各10只。选取同一时间节点（术后12小时、24小时和48小时）不同组别间（正常对照组、假手术组和手术组）同等数量的小鼠,在摘取眼球取血后进行腹腔灌洗液收集并送培养。ELISA法检测不同组别小鼠12小时、24小时和48小时血清中CRP、FIB和sB7H3水平。结果:（1）正常对照组和假手术组小鼠腹腔培养结果均为阴性,CLP术后组小鼠腹腔培养结果均为阳性。（2）手术组（包括术后12小时组、24小时组和48小时组）小鼠的sB7H3、CRP均显著高于对照组和假手术组;手术组（包括术后12小时组、24小时组和48小时组）小鼠的FIB值显著低于对照组和假手术组。（3）手术后48小时组小鼠的CRP值显著高于12小时组和24小时组,但手术后12小时组和24小时组的CRP值差异不明显;（4）手术后48小时组的FIB值明显低于12小时组和24小时组,但手术后12小时组和24小时组的FIB值差异不明显;（5）手术后12小时组、24小时组和48小时组间的sB7H3值均有统计学意义。结论:sB7H3在脓毒症小鼠中显著升高,而且随着时间进展呈现不断显著升高的趋势。