背景:胰腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）是临床常见恶性肿瘤,也是癌症相关死亡主要原因;近年来,随着手术、化疗、放疗、靶向、免疫等综合治疗水平的不断提高,胰腺癌疗效有所提高,但总体预后仍不容乐观,5年生存率不足10%。胰腺癌治疗手段相对有限,手术是唯一能根治的方法,但仅10～15%的病人有手术机会;化疗仍是其治疗的主要手段。但临床上存在显著的获得性耐药难题、从而导致治疗失败。胰腺癌化疗耐药受多因素、多水平、多基因调控,其具体机制尚不明确。从全基因组水平、对肿瘤耐药表型进行深入研究,从耐药基因上游水平找到肿瘤耐药关键调控因子、揭示调控因子之间的复杂调控网络,对克服化疗耐药、增强其化疗敏感性、提高化疗疗效进而改善患者预后具有极大的临床意义。因此,采用以功能为基础、基于耐药表型的高通量筛选,获得耐药相关调控因子及其复杂调控网络,对于阐明肿瘤化疗耐药发生的分子机制具有重要意义。生物是一个有机整体,生命活动的完成往往需要多个调控因子进行多角度、多时空协同精确调控;仅针对单个调控因子进行研究,在研究肿瘤化疗耐药等复杂疾病表型时,往往显得事倍功半。构建文库进行生物表型筛选成为基因及基因组研究的重要工具,构建大样本文库在功能基因组学研究中显示出广阔的应用前景。既往已有应用全基因组siRNA文库、CRISPR-Cas9文库进行大规模、高通量功能基因筛选从而获得关键调控因子或重要表型的经验。因此,我们拟构建一个全新的、覆盖全基因组的、完全随机的、含29个随机碱基序列的小调控RNA（small regulatory RNA,srRNA）文库,利用该文库筛选出被特异srRNA调控后、表达水平发生变化的引起肿瘤耐药调控因子,并揭示其耐药机制。吉西他滨（Gemcitabine,GEM）是NCCN指南推荐的术后辅助、新辅助、局部晚期以及转移、复发胰腺癌的一线化疗药物;但有报道称1年内GEM耐药复发率高达50%。筛选GEM耐药相关调控因子并对其机制进行研究,具有重要的临床意义。该srRNA文库的构建及应用为胰腺癌耐药机制研究提供了新的手段,为阐明肿瘤耐药机制带来了新的契机;新的胰腺癌耐药相关调控因子的发现和研究,将为胰腺癌患者提供新的基因治疗基础。目的:1、构建一个完全随机的、覆盖全基因组的、大样本的、高多样性的、含29个随机碱基序列的srRNA逆转录病毒质粒文库。2、利用该srRNA质粒文库在胰腺癌细胞BxPC3中进行GEM耐药表型筛选,并进行耐药表型验证。3、验证srRNA对胰腺癌细胞GEM耐药的作用。4、探讨细胞自噬在胰腺癌GEM耐药中的作用及其可能的调控机制。方法:1、通过化学合成法合成含有完全随机29个碱基的RNA片段,经PCR扩增并形成双链DNA作为Gibson组装的原始片段;以逆转录病毒骨架pSOKd（含有ccdB自杀基因）质粒为载体,利用U6/H1双启动子控制系统,Gibson Assembly法在其U6/H1启动子之间组装入含随机排列29个碱基的RNA片段,构建srRNA逆转录病毒质粒文库;琼脂糖平板克隆计数、特异性菌落PCR验证、质粒DNA测序等方法鉴定。2、将pSOK-N29 srRNA文库在293PA细胞中进行逆转录病毒包装,感染胰腺癌细胞BxPC3,BSD（5 μg/mL）筛选去除未整合文库细胞,用致死剂量GEM（2 μM）进行第1轮筛选,短时间内快速提高GEM浓度至16 μM;使用WST-1、结晶紫染色、克隆形成实验、划痕实验、Tq-PCR、裸鼠抑瘤实验等验证耐药表型。3、提取耐药细胞株BxPC3-GR细胞基因组DNA（genomic DNA,gDNA）,巢式PCR扩增N29 srRNA文库所在的gDNA区域,构建DNA测序文库,高通量DNA测序、并分析富集的N29 srRNA片段（gemcitabine resistance tags,GRT）;按照碱基配对原则进行srRNA文库序列不完全匹配靶基因（mRNA、lncRNA）预测;选取富集度排前10位的N29 srRNA片段（GRT 1～10）,分别构建含该单个片段稳定表达的pSOK-GRT质粒,293PA细胞逆转录病毒包装、感染胰腺癌细胞BxPC3、BSD筛选获得单片段GRT稳定表达的胰腺癌细胞株BxPC3-GRT（1～10）,不同浓度GEM处理BxPC3-PA、BxPC3-GRT细胞72 h,结晶紫活细胞染色验证其耐药能力;选取富集程度最高、耐药能力最强的N29 srRNA片段（GRT1）,按照碱基配对原则、在数据库中进行序列比对,预测其可能靶向调控的lncRNA,并经qRT-PCR进行验证;选取lncRNA-LINC00339、在StarBase数据库中进行序列比对,预测其可能靶向调控的mRNA,并经qRT-PCR进行验证。4、不同浓度GEM协同氯喹（Chloroquine,CQ）、DMSO、雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）处理BxPC3-PA、BxPC3-GR细胞,WST-1、结晶紫染色、克隆形成实验、Ad-mRFP-EGFP-LC3检测自噬小体、Tq-PCR等实验探讨细胞自噬在胰腺癌GEM耐药中的作用及其可能的调控机制。结果:1、经感受态细菌电转涂板、克隆计数、特异性菌落PCR、质粒测序等方法鉴定,该质粒文库单次Gibson Assembly组装的克隆数约为1.37×107,质粒阳性率达到96.25%,随机挑选20个菌落PCR阳性的克隆进行质粒测序鉴定,发现29个碱基序列没有重复,且转录终止密码子TTTTT准确无误;从而成功构建了一个全新的、完全随机的、覆盖全基因组的、大样本的、高多样性的、含29个随机碱基序列的pSOK-N29 srRNA逆转录病毒质粒文库。2、将pSOK-N29 srRNA文库在293PA细胞中进行逆转录病毒包装,感染胰腺癌细胞BxPC3,BSD（5 μg/mL）筛选去除未整合文库细胞,用致死剂量GEM（2 μM）进行第1轮筛选,短时间内快速提高GEM浓度至16μM,2个月左右即可获得耐药细胞株BxPC3-GR;结晶紫染色显示BxPC3-GR细胞对GEM有更强的耐药性,对PTX具有一定程度的交叉耐药性;WST-1检测发现BxPC3-GR细胞的增殖速度显著低于BxPC3-PA 细胞,BxPC3-PA 细胞的 IC50 为 0.70 μM,BxPC3-GR 细胞的 IC50 为 15.49μM,RI（resistant index,RI）约 22.13（=15.49/0.70）;BxPC3-GR 细胞所形成的克隆数明显多于BxPC3-PA细胞,BxPC3-GR细胞具有更强的克隆形成能力及干性;划痕实验提示BxPC3-GR细胞迁移能力明显高于BxPC3-PA细胞,BxPC3-GR细胞向远处转移的潜能明显提高;Tq-PCR检测发现BxPC3-GR细胞中多个耐药相关基因（MDR1、MRP1、MRP2、MRP3、ATP7A、ATP7B、CTR1、CTR2、ABCB1、ABCC1、ABCC2、ABCG2、GST-pi、ERCC1、LRP）的表达明显升高,细胞干性、上皮间质转化（EMT）增强;裸鼠抑瘤实验显示BxPC3-GR组成瘤瘤体显著大于BxPC3-PA组,BxPC3-GR给药组、对照组成瘤瘤体无显著差异,BxPC3-PA给药组成瘤瘤体显著小于对照组,耐药细胞株BxPC3-GR具有较强耐药能力、细胞恶性程度增高、并表现出稳定的耐药表型。最终,利用该pSOK-N29 srRNA文库成功快速筛选出胰腺癌GEM耐药细胞株BxPC3-GR,并表现出稳定的耐药表型。3、经华大基因科技有限公司高通量DNA测序和数据分析,共测得了约2.36×107个N29 srRNA片段（GRT）,其中富集度较高的前20个片段富集率均在0.5%以上,且reads大于1.1×105,达到了我们预期设想,可用于后续功能实验;进行srRNA文库序列不完全匹配靶基因（mRNA、lncRNA）预测,富集的N29 srRNA片段（GRT）与mRNA序列匹配性很低、与lncRNA序列匹配性较高,提示富集的N29 srRNA片段（GRT）不直接靶向mRNA、而是主要靶向lncRNA,从而发挥其调控作用;GRT单片段、BxPC3细胞GEM耐药验证发现:BxPC3-GRT 1、3、8细胞有较强的耐药能力,其中BxPC3-GRT 1细胞在16μM GEM处理下仍能大量存活、耐药能力最强,提示GRT 1、3、8可能是介导胰腺癌GEM耐药相关的N29 srRNA（GRTx）;GRT1可能靶向调控的 lncRNA 有 4 个,分别为 LINC00339、LOC389641、LINC00675、ENST00000480739,分别有14个或19个碱基与lncRNA匹配,qRT-PCR发现此4个lncRNA在BxPC3-GR、BxPC3-GRT1细胞中表达显著高于BxPC3-PA细胞,再次证实富集的N29 srRNA片段（GRT）主要靶向靶向调控lncRNA,发挥其调控胰腺癌GEM耐药的作用;LINC00339可能靶向调控的mRNA有4个,分别为DICER1、mTOR、GATA3、IGF1R,qRT-PCR 发现此 mTOR 在 BxPC3-GR、BxPC3-GRT1 细胞中表达显著低于BxPC3-PA细胞,DICER1、GATA3、IGF1R的表达无明显差异,提示LINC00339靶向调控其下游mTOR基因,发挥其调控胰腺癌GEM耐药的作用,即GRT1-LINC00339-mTOR-GEM耐药垂直调控轴;而我们利用全基因组pSOK-N29 srRNA文库筛选获得的胰腺癌GEM耐药细胞株BxPC3-GR可能存在多条GRTx-靶lncRNA-耐药基因-细胞耐药垂直调控轴。4、不同浓度 GEM 协同 CQ、DMSO、Rapa 处理 BxPC3-PA、BxPC3-GR 细胞,结晶紫染色显示BxPC3-PA存活细胞数变化不大,BxPC3-GR存活细胞数Rapa组显著高于DMSO组、CQ组显著低于DMSO组;WST-1检测发现CQ、DMSO、Rapa未能显著改变BxPC3-PA细胞IC50,而协同Rapa显著增加了 BxPC3-GR细胞IC50、协同CQ显著降低了 BxPC3-GR细胞IC50;克隆形成实验发现BxPC3-GR形成的克隆数显著多于BxPC3-PA细胞,BxPC3-PA细胞CQ、DMSO、Rapa各组间克隆形成数差异不明显,BxPC3-GR细胞Rapa组克隆形成数显著高于DMSO组、CQ组克隆形成数显著低于DMSO组;应用自噬检测病毒Ad-mRFP-EGFP-LC3检测自噬小体,发现BxPC3-GR较BxPC3-PA自噬小体明显增多,BxPC3-PA细胞CQ、DMSO、Rapa各组自噬小体差异不明显,BxPC3-GR细胞Rapa组自噬小体显著高于DMSO组、CQ组自噬小体显著低于DMSO组;Tq-PCR检测发现自噬相关基因Beclin1、ULK1、Atg5、LC3B等的表达在BxPC3-GR显著高于BxPC3-PA细胞,BCL2、mTOR等的表达在BxPC3-GR显著低于BxPC3-PA细胞;说明自噬激活在胰腺癌GEM耐药中发挥了显著作用,抑制自噬可逆转GEM耐药、恢复胰腺癌细胞GEM敏感性,提高化疗疗效,抑制自噬可以作为新的治疗靶点,为胰腺癌GEM耐药患者提供新的基因治疗基础。结论:1、利用分子克隆技术、Gibson Assembly法成功构建了一个全新的、完全随机的、覆盖全基因组的、大样本的、高多样性的、含29个随机碱基序列的pSOK-N29 srRNA逆转录病毒质粒文库。2、利用该pSOK-N29 srRNA文库成功快速筛选出胰腺癌GEM耐药细胞株BxPC3-GR,具有较强耐药能力、细胞恶性程度增高、并表现出稳定的耐药表型。3、高通量DNA测序获得符合设想的富集N29 srRNA片段（GRT）,其通过GRTx-靶lncRNA-耐药基因-细胞耐药垂直调控轴发挥其调控作用。4、自噬激活在胰腺癌GEM耐药中发挥了显著作用,抑制自噬可逆转GEM耐药、恢复胰腺癌细胞GEM敏感性,提高化疗疗效,抑制自噬可以作为新的治疗靶点,为胰腺癌GEM耐药患者提供新的基因治疗基础。