前言急性冠状动脉综合征（acute coronary syndrome,ACS）是最严重的心血管疾病之一,也是全世界发病率和死亡率最高的疾病之一。急性冠状动脉综合征包括不稳定型心绞痛（unstable angina,UA）、非 ST 段抬高型心肌梗死（non-ST-segment elevation myocardial infarction,NSTEMI）和 ST 段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction,STEMI）。早期准确诊断急性冠状动脉综合征无疑可以降低死亡率,心电图（electrocardiogram,ECG）显示ST段抬高且患者出现典型症状者不难诊断,此类患者诊断为STEMI,但对于NSTEMI或UA的患者,往往缺乏典型的临床症状和ECG表现。迄今为止,最常用的心肌梗死（cardiac infarction,MI）生物标志物是心肌肌钙蛋白（cardiac troponins,cTns）,如心肌肌钙蛋白I和T（cardiac troponin I and T,cTnI和cTnT）,但这些生物标志物在症状发作后的最初几个小时内并未升高,以致延误早期诊断,因此,迫切需要探索新型的用于诊断急性冠状动脉综合征的生物标志物,其可以在入院后立即可靠地诊断或排除急性冠状动脉综合征。基因组学和转录组学研究的进展表明,人类基因组中只有2%由蛋白质编码序列组成,并且大部分基因组被转录为非编码RNA（non-coding RNAs,ncRNA）,非编码RNA可以分为短链ncRNA和长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）两种不同类型,大量研究结果表明,循环中的lncRNA可能成为诊断急性冠状动脉综合征的潜在标志物。LncRNAs是被转录的超过200个核苷酸长度的非编码RNA,其经由染色质调节、转录后调控、蛋白质复合物、细胞信号传导和变构调节等转录,其在生理过程中扮演十分重要的角色,包括细胞分化、增殖、凋亡、侵袭和诱导多能干细胞等。研究表明,几种lncRNAs（包括lncRNA-p21、与转移相关的肺腺癌转录本1和lnc-Ang362）与动脉粥样硬化的进展过程密切相关,此外,已经证实lncRNAs参与调节内皮细胞的功能。在各种疾病中已经检测到lncRNAs的异常表达,特别是癌症。先前的研究表明,lncRNAs表达失调会导致心血管疾病的发生和发展,例如,lncRNAANRIL通过参与调节组蛋白的甲基化进而成为冠心病的重要危险因素,lncRNA心肌梗死相关转录本也与心肌梗死密切相关。然而,到目前为止,人们对lncRNA表达模式及其在急性冠状动脉综合征进展中的功能的了解仍处于起步阶段。本研究通过基因芯片技术筛选出了在急性冠状动脉综合征患者血液中表达上调的lncRNAENST00000538705.1及其共表达的mRNAALOX15,并进一步在人冠状动脉内皮细胞和心肌梗死大鼠模型中探讨了二者在急性冠状动脉综合征的作用和潜在的分子机制。第一部分 急性冠脉综合征患者循环中差异表达的长链非编码RNA的筛选目的:通过基因芯片技术筛选出急性冠状动脉综合征患者血液中差异表达的lncRNAs并探索其生物学功能。方法:收集2018年6月-2018年10月在温州市人民医院心内科住院的10例急性冠脉综合征患者和10例健康参与者（其中男性12例,女性8例）的全血样本,各选取5例急性冠脉综合征患者和5例健康参与者的全血样本用于芯片分析,其中各1例芯片RNA质检不合格。采用Trizol（Invitrogen,USA）法提取全血总RNA,并进一步采用NucleoSpin?RNA clean-up试剂盒对总RNA进行过柱纯化,分光光度计法用于定量并通过琼脂糖凝胶电泳法检测其完整性。总RNA反转录合成第一链cDNA和第二链cDNA,体外转录合成cRNA以及cRNA反转录。将反转录的cDNA产物进行纯化,并通过紫外分光光度计对纯化后的荧光标记产物进行荧光掺入量和核酸定量。芯片经杂交、清洗及扫描后使用GeneSpring软件V13.0分析lncRNA+mRNA芯片数据,进行数据汇总、归一化和质量控制。为了选择差异表达的基因,设定倍数变化≥2、Benjamini-Hochberg校正的p值＜0.05。基于差异表达的lncRNA与mRNA的相关性分析构建lncRNA-mRNA共表达网络。对于每对基因计算Pearson相关性,并选择显著相关的关系对构建网络。此外,预测了顺式和反式的lncRNAs。结果:1.与对照组相比,在急性冠脉综合征患者的样本中确定了111个上调的lncRNAs和242个下调的lncRNAs,筛选出了与急性冠脉综合征相关的266个上调的mRNAs和175个下调的mRNAs。2.基于|相关系数|＞0.99且p值＜0.05的筛选标准,构建了lncRNA-mRNA共表达网络。在lncRNA与mRNA共表达筛选结果的基础上,cis-预测寻找基因组位置在10kb之内的 lncRNA-mRNA 对,trans-预测利用blat 工具对 lncRNA 和 mRNA（3’-UTR）序列进行比对,筛选序列相似的lncRNA-mRNA关系对。对每一个lncRNA起始位点上游2000bp和下游500bp区域与转录因子的结合情况进行预测并挑选出lncRNA的转录因子。预测了lncRNA和RNA结合蛋白（RNA binding protein,RBP）。3.功能富集分析提示lncRNA及其共表达的mRNA、转录因子和RNA结合蛋白参与多种重要的生物学过程。结论:本研究通过基因芯片技术发现了急性冠脉综合征患者血液中差异表达的lncRNAs和mRNAs,lncRNA及其共表达的mRNA、转录因子和RNA结合蛋白参与多种重要的生物学过程。第二部分 LncRNA ENST00000538705.1和mRNA ALOX15促进人冠状动脉内皮细胞的增殖和迁移目的:基于基因芯片技术研究急性冠状动脉综合征患者血液中差异表达的新型lncRNA ENST00000538705.1,并探讨其对人冠状动脉内皮细胞增殖和迁移的作用。方法:应用Real-time PCR检测了 10例急性冠脉综合征患者和10例健康参与者全血样本的 ALOX15、ENST00000538705.1 和 ENST00000556936.1 的表达水平。培养人冠状动脉内皮细胞（human coronary artery endothelial cells,HCAECs）,用 Real-time PCR检测人冠状动脉内皮细胞中 ALOX15、ENST00000538705.1 和 ENST00000556936.1的表达水平。设计并合成了 homo ALOX15 siRNA 以及homo lncRNA ENST00000538705.1 siRNA（各三条）并用 ALOX15 siRNA 和 ENST00000538705.1 siRNA转染人冠状动脉内皮细胞,转染24、36、48和72h后进行CCK8检测。转染24h后,进行细胞划痕实验以评估细胞迁移的能力。此外,采用western blot检测ALOX15蛋白质的表达水平。结果:1.与正常对照组相比,lncRNA ENST00000538705.1在急性冠脉综合征患者全血中的表达上调,差异有统计学意义（0.70±0.35 vs 0.07±0.13,n=10;p＜0.05）。与正常对照组相比,lncRNA ENST00000556936.1在急性冠脉综合征患者全血中的表达下调（0.46±0.14 vs 1.37±0.61,n=10;p＜0.001）,差异也有统计学意义。2.生物信息学分析结果表明,在急性冠脉综合征患者中,mRNA ALOX15与lncRNA ENST00000538705.1共表达。通过Real-time PCR检测10名急性冠脉综合征患者和10名健康人全血中ALOX15的表达模式,结果表明mRNA ALOX15与lncRNA ENST00000538705.1一样,在急性冠脉综合征患者血液中高表达。与正常对照组相比,急性冠脉综合征患者血液中ALOX15 mRNA的表达水平显著升高（0.03±0.003 vs 3.11±0.11,n=10;p＜0.001）。3.为了避免siRNA脱靶,分别设计和合成了三条si-ENST00000538705.1和si-ALOX15转染人冠状动脉内皮细胞,Real-time PCR用于评估沉默效果最好的siRNA。与si-NC相比,转染si-ENST00000538705.1和si-ALOX15的人冠状动脉内皮细胞中ENST00000538705.1（分别为0.839±0.109 vs 0.506±0.036,0.238±0.054和 1.017±0.046,n=3;p＜0.0001）和ALOX15（分别为0.879±0.148 vs 0.381±0.025,0.682±0.150和0.678±0.097,n=3;p＜0.001）的表达水平显著降低,表明ENST00000538705.1和ALOX15被成功地抑制。然而,与si-NC相比,转染si-ALOX15的人冠状动脉内皮细胞中ENST00000538705.1的表达水平并未发现显著改变,但转染了si-ENST00000538705.1的人冠状动脉内皮细胞中ALOX15 mRNA和蛋白质表达显著降低,提示lncRNA ENST00000538705.1可能促进人冠状动脉内皮细胞中ALOX15的表达,其与生物信息学的研究结果一致。4.CCK-8用于评估人冠状动脉内皮细胞的增殖情况。分别对转染si-ENST00000538705.1或者si-ALOX15后的24小时、36小时、48小时和72小时的人冠状动脉内皮细胞进行了 CCK-8检测,结果显示,与si-NC相比,随着时间的推移,转染si-ENST00000538705.1的人冠状动脉内皮细胞的增殖能力显著降低（p＜0.0001）;与si-NC相比,随着时间的推移,si-ALOX15显著的降低了人冠状动脉内皮细胞的增殖（p＜0.0001）。5.细胞划痕用于评估人冠状动脉内皮细胞的迁移能力。使用si-ENST00000538705.1或者si-ALOX1 5分别转染人冠状动脉内皮细胞后进行细胞划痕,沉默lncRNAENST00000538705.1或者ALOX15显著降低人冠状动脉内皮细胞的迁移能力（p＜0.05）。在后续研究中,我们将明确LncRNAENST00000538705.1的核质分布情况,并通过RNA免疫共沉淀实验、RNA pull down实验结合蛋白质质谱,分析与该lncRNA发生相互作用的蛋白分子,并进一步论证相关结合蛋白是否介导该lncRNA的功能。此外,我们将探索是否LncRNA ENST00000538705.1可以通过“miRNA海绵”方式发挥作用。结论:1.LncRNAENST00000538705.1和ALOX15 mRNA在急性冠脉综合征患者血液中高表达,生物信息学提示lncRNAENST00000538705.1和ALOX15 mRNA共表达。2.沉默lncRNA ENST00000538705.1显著抑制ALOX15 mRNA和蛋白质的表达,沉默lncRNA ENST00000538705.1或者ALOX15 mRNA抑制人冠状动脉内皮细胞的增殖和迁移能力。第三部分 沉默LncRNA ENST00000538705.1和mRNA ALOX15改善心肌梗死大鼠的心肌损伤目的:基于前两部分的研究,本部分旨在建立心肌梗死大鼠模型,研究沉默lncRNA ENST00000538705.1或mRNA ALOX15对心肌梗死的影响并探讨lncRNA ENST00000538705.1 和 mRNA ALOX15 二者之间的调控关系。方法:将20只健康的成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组（n=5）、心肌梗死模型组（n=5）、心肌梗死+si-ENST00000538705.1组（n=5）和心肌梗死+si-ALOX15组（n=5）。通过结扎左冠状动脉的方法建立急性心肌梗死实验模型,两周后取心脏组织进行H＆E染色观察心肌组织的病理情况。检测假手术组、心肌梗死组、心肌梗死+si-ENST00000538705.1组和心肌梗死+si-ALOX15组大鼠血清总胆固醇（total cholesterol,TC）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）和高密度脂蛋白（high-density lipoprotein,HDL）水平。Real time PCR检测四组大鼠血清中 lncRNA ENST00000538705.1 和 mRNAALOX15 的表达水平。Western blot 用于检测四组大鼠血清中ALOX15蛋白的表达水平。结果:1.假手术组大鼠的心肌细胞排列较均匀,无断裂,为正常心肌细胞的形态;心肌梗死模型组的心肌细胞肿胀增粗最为明显,形态极不规则,排列紊乱;经si-ENST00000538705.1和si-ALOX15干预的心肌梗死大鼠的心肌细胞肥大和排列紊乱均有不同程度减轻,而心肌梗死+si-ALOX1 5组大鼠改善更为明显。2.与假手术组大鼠相比,心肌梗死大鼠血清中总胆固醇（2.15倍;p＜0.0001）、低密度脂蛋白（3.68倍;p＜0.0001）水平显著升高而高密度脂蛋白水平（0.24倍;p＜0.0001）显著降低。与心肌梗死大鼠相比,经si-ENST00000538705.1或si-ALOX15干预的心肌梗死大鼠血清中总胆固醇（0.90倍,p＜0.05;0.69倍,p＜0.0001）和低密度脂蛋白（0.85倍,p＜0.05;0.63倍,p＜0.01）水平显著降低而高密度脂蛋白（2.16倍,p＜0.05;3.16倍,p＜0.0001）水平显著升高。3.与假手术组相比,心肌梗死大鼠血清中ENST00000538705.1（1.47倍;p＜0.0001）和ALOX15 mRNA（1.72倍;p＜0.0001）表达水平显著升高。与心肌梗死大鼠相比,经si-ENST00000538705.1或者si-ALOX15干预的心肌梗死大鼠血清中lncRNA ENST00000538705.1（0.28倍;p＜0.0001）和ALOX15 mRNA（0.29倍;p＜0.0001）表达水平显著降低。与假手术组相比,心肌梗死大鼠血清中ALOX15蛋白表达水平显著升高（1.459倍;p＜0.001）。与心肌梗死大鼠相比,经si-ENST00000538705.1（0.76倍;p＜0.0001）或si-ALOX15干预的心肌梗死大鼠血清中ALOX15蛋白表达水平显著降低（0.74倍;p＜0.0001）。结论:1、心肌梗死大鼠血清中总胆固醇、低密度脂蛋白水平显著升高而高密度脂蛋白水平显著降低,沉默lncRNA ENST00000538705.1或者ALOX15 mRNA改善心肌梗死大鼠的心肌损伤及血清中总胆固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白水平。2、心肌梗死组大鼠血清中ENST00000538705.1和ALOX15 mRNA表达水平显著升高,沉默lncRNA ENST00000538705.1显著降低血清中ALOX15 mRNA和蛋白质的表达水平。