源于T.fusca纤维素酶E4的结构域重组及其功能研究

来源 :华南理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:fsongyifa
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为了研究纤维素的利用及实现纤维素乙醇的工业化生产,目前最为普遍接受的研究思路包括两方面:筛选具有良好纤维素降解能力的纤维素酶,包括微生物筛选、代谢工程改造、蛋白质工程改造等;筛选具有良好外源蛋白表达能力的工程菌,实现工业生产的高密度培养,同时高效表达外源蛋白。本实验筛选了一种来源于嗜热菌Thermobifida fusca的兼具内切酶和外切酶活性的特殊纤维素酶:纤维素酶E4,此酶结构域包括E4CD+CBD3+FNⅢ+CBD2。纤维素结合域CBD对纤维素酶与纤维素的结合有着重要影响,而纤维素降解的最关键点便是酶的有效附着。为了获取具有大量表达的纤维素酶E4,并且分析其中两个不同CBD的功能,设计并成功构建了四组质粒:pGAPZαA-E4,pGAPZαA-E4CBD3,pGAPZαA-E4CBD2,pGAPZαA-E4CD,并将其转化入毕赤酵母蛋白高效外源表达系统,得到四组重组酶。使用可溶性纤维素CMC为底物对四组酶的基本性质:最适反应温度、pH、温度稳定性等方面进行了研究,结果显示,仅删除一个结合域(E4CBD3、E4CBD2与E4比较)对酶的最适反应温度、pH及稳定性会造成影响,但对最佳酶活性的影响不大。将两个结合域全部删去,只保留催化域的E4CD,则无论是稳定性还是最佳酶活性方面都受到较大影响。通过不同底物酶活力差别的对比发现,对于可溶性纤维素,四种酶的降解能力相差不大,即使E4CD的酶活也能占到E4酶活的75%。而对于非可溶性纤维素,E4CBD2与E4CD几乎没有降解能力;E4CBD3的微晶纤维素酶活占E4的36%,而滤纸酶活占E4的82%。推测结合域CBD3对于纤维素酶与纤维素结晶区的结合有重要作用,而CBD2单独作用并没有显著优势,说明其作用可能不仅仅限定在与底物的结合上,可能与其它方面的作用有关,如酶与其它类型纤维酶的协同性、水解反应的持续性、纤维素表面氢键破坏等。
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