背景肝细胞癌（HCC）是肝癌的最主要类型,在肿瘤致死原因中位居第三。索拉非尼,一种多靶点、多激酶抑制剂,已经成为晚期HCC治疗的标准用药,但经其治疗的肿瘤却不能完全消退,并且高发耐药性,因此迫切需要描述耐药的驱动因素,开发提高索拉非尼疗效的新治疗策略。葡萄糖基神经酰胺酶（GBA）,是糖苷水解酶家族30的成员之一,在复杂脂质的降解、细胞膜的周转以及胆固醇代谢中起着重要作用。研究报道,抑制GBA的酶活性能够提高胃癌和乳腺癌对化疗的敏感性。然而,GBA在HCC进展中的作用以及具体的调控机制目前还没有相关的报道。因此,探究GBA对HCC发生的作用和调控机制有可能为临床HCC治疗提供新的思路。胆固醇生成,被认为是癌症的重要标志。已有证据表明,脂肪酸和胆固醇的生物合成对多种肿瘤的发生和发展至关重要,因为它们是膜组件的关键组成部分。此外,细胞内胆固醇水平的升高与癌细胞中致癌生长信号密切相关。虽然胆固醇生成途径被认为是癌症治疗的一个有希望的药物靶点,但对使HCC对降胆固醇药物的作用敏感并提高抗癌效果的能力的研究却很少。本研究中,我们在体外评估了GBA在HCC细胞系中的致癌作用,并开发了肝细胞特异性GBA敲除(GBALKO)小鼠,在体内评估GBA对HCC进展的影响。我们还阐明了GBA调控HCC进展的作用机制,并在异种移植和原位移植的HCC小鼠模型中评估了GBA抑制剂CBE治疗HCC的潜力以及CBE和索拉非尼的联合应用的抗癌效果。目的本研究旨在探讨GBA在HCC癌症组织中的表达水平;探讨GBA在HCC进展中的作用及分子机制;探讨GBA抑制剂CBE治疗HCC的潜在价值及作用机制;探讨GBA抑制剂CBE与索拉非尼协同治疗HCC的作用及机制。方法收集12对临床HCC患者的癌标本及配对的癌旁标本,利用LC-MS/MS质谱技术分析组织标本中差异性表达的蛋白分子;通过Real time PCR、Western blot和免疫组织化学技术检测癌及癌旁标本中GBA的表达水平、在TCGA（癌症基因组图谱）数据库中检索并分析GBA在HCC不同临床病理特征中的表达水平,以及GBA和HCC生存率的相关性。为了探讨GBA在HCC进展中的作用及调控机制,体外实验中,使用过表达载体和特异性小干扰RNA（si RNA）在人肝癌细胞系中过表达和沉默GBA基因、以及构建GBA稳定高表达的细胞系（Hep G2-GBA）和GBA稳定敲除的细胞系（SKHEP-sg GBA）,对肝癌细胞进行GBA过表达或敲低处理后,利用CCK-8实验和细胞克隆形成实验检测GBA对HCC细胞增殖的影响、Transwell实验检测GBA对HCC细胞迁移及侵袭能力的影响、流式细胞分析和TUNEL实验中检测GBA对HCC细胞凋亡的影响、ELISA检测GBA对细胞内胆固醇及胆固醇酯的含量以及Western blot检测细胞内胆固醇合成关键分子的蛋白表达水平;体内实验中,分别将GBA稳定敲除细胞系（SKHEP-sg GBA细胞）及GBA稳定高表达细胞系（Hep G2-GBA细胞）（2×10~6/100μL PBS）,经皮下注射到6周龄雄性BALB/c裸鼠的左侧背部,通过观察小鼠肿瘤体积、肿瘤结节的大小和肿瘤组织病理学分析检测GBA对异种移植HCC小鼠模型的影响。构建肝细胞特异性GBA敲除(GBALKO)小鼠,通过流体动力注射技术构建小鼠原位HCC模型,检测肝肿瘤生长、肝肿瘤的胆固醇及胆固醇酯含量、肝肿瘤的病理改变、肝细胞内胆固醇合成关键分子的蛋白水平以及脂质组学分析检测GBA对原位移植HCC小鼠模型的影响。为了评估GBA抑制剂Conduritol B Epoxide（CBE）治疗HCC的潜力,体外实验中,在不同的肝癌细胞中,分别给予不同浓度的CBE（0μM,30μM,100μM,300μM,600μM,800μM）处理,药物作用一定时间后,分析不同浓度CBE干预后肝癌细胞的增殖及凋亡水平;分别给予CBE（600μM）或索拉非尼（5μM）药物干预肝癌细胞,在体外分析GBA与索拉非尼联合治疗的效果。在体内实验中,分别构建异种移植和原位移植的HCC小鼠模型,将小鼠随机分为四组:对照组（Control）小鼠给予PBS（腹腔注射,每三天一次）,GBA抑制剂治疗组（CBE）小鼠接受剂量为100 mg/kg的CBE（腹腔注射,每三天一次）,索拉非尼治疗组（SF）组小鼠接受剂量为60 mg/kg的SF（口服,每天）,CBE+SF治疗组小鼠接受100 mg/kg CBE+60 mg/kg SF。连续给药三周,在治疗结束后对小鼠实施安乐死,并收集小鼠的肿瘤肿块进行分子生物学和组织病理学分析。结果临床HCC患者的肝肿瘤组织和正常组织进行蛋白质组学分析,结果发现HCC肝肿瘤组织中GBA显著性高表达,且具有明显的统计学差异;Real time PCR、Western blot实验及免疫组化染色实验检测结果显示HCC肝肿瘤组织中GBA的m RNA水平和GBA的蛋白水平均明显增多;TCGA（癌症基因组图谱）数据库分析显示GBA在HCC中表达升高并与肝癌患者预后不良相关。体外实验结果显示,GBA能够促进肝癌细胞增殖、迁移及侵袭,当GBA被抑制时,肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力也被抑制;GBA高表达能够抑制肝癌细胞的凋亡,GBA表达降低时能够诱导肝癌细胞凋亡;GBA高表达时肝癌细胞内胆固醇总胆固醇、游离胆固醇及胆固醇酯的含量呈升高的趋势,GBA的表达降低时,他们的含量也降低;GBA高表达时细胞内胆固醇生物合成的关键蛋白（SREBP2、LDLR）、对肿瘤生长和转移至关重要的质膜上的多个受体（ITGAV、ITGB4和TGFβR1）的蛋白表达水平明显升高,PI3K/AKT/m TOR致癌信号通路被激活,细胞增殖分子的蛋白表达水平明显升高,而促凋亡分子的蛋白水平出现下调。异种移植HCC小鼠模型中观察到接种了GBA稳定高表达细胞裸鼠的异种移植肿块的生长速度和体积大小明显高于对照组;通过流体动力学注射方法转染PIK3CA/c-Met质粒到肝细胞特异性GBA敲除小鼠(GBALKO)和对照小鼠(GBAfl/fl)体内,结果显示GBALKO小鼠肝肿瘤发生率明显低于GBAfl/fl小鼠肝肿瘤、GBALKO小鼠肝肿瘤的胆固醇及胆固醇酯含量明显降低、GBALKO小鼠肝肿瘤的胆固醇合成信号通路的蛋白水平明显降低。不同浓度GBA抑制剂Conduritol B Epoxide（CBE）作用肝癌细胞后,肝癌细胞的增殖水平明显被抑制,而凋亡水平明显升高、细胞内胆固醇及胆固醇酯的含量明显降低、细胞内胆固醇合成关键基因的蛋白水平也被抑制;CBE和索拉非尼（SF）联合作用肝癌细胞后,肝癌细胞的增殖水平显著降低,且抑制效率高于CBE或SF单独治疗组、CBE和SF联合作用后显著诱导肝癌细胞凋亡,细胞凋亡比例高于CBE或SF单独治疗组;在异种移植和原位移植HCC小鼠模型中进一步验证了CBE或CBE联合SF的治疗效果,结果显示CBE单独或与SF联合使用均可抑制体内肿瘤的生长,并且CBE与SF联合治疗的抑制效果更加明显。结论GBA通过促进细胞内胆固醇和胆固醇酯的积累驱动HCC的发生,抑制GBA能够降低细胞内胆固醇合成进而抑制体内肿瘤的生长,并且增强索拉非尼对HCC治疗的敏感性。