目的肠肽酶（Enteropeptidase,EP）通过胰蛋白酶原的蛋白水解过程启动肠道消化,产生具有催化活性的胰蛋白酶。EP功能失调会引起一系列胰腺疾病,其中最为严重的是急性重症胰腺炎。然而,由于缺乏完整的结构信息,EP激活和底物识别的分子机制仍有待研究。本研究拟通过深入探索EP及其与底物结合的空间构象和生物学特性来揭示其参与疾病发生发展的分子机制。方法通过基因重组、蛋白表达和纯化等技术获取高纯度野生型及突变型非激活态EP蛋白,利用胰蛋白酶对两种EP蛋白进行激活,使其转变为激活态模式。采用酶活性检测、免疫印迹法、SDS-PAGE和Native-PAGE电泳等技术对不同状态EP进行检测。将萘莫司他（nafamostat）与活性EP共孵育,胰蛋白酶原与突变型EP相交联,经分子筛纯化后获得高纯度EP与抑制剂或底物结合的复合物。利用单颗粒冷冻电镜对非激活态、激活态、突变型、抑制剂结合型和底物结合型EP进行三维结构解析。结果通过体外表达纯化获得了高纯度糖基化的野生型和突变型单链EP蛋白。经SDS/Native-PAGE电泳及免疫印迹等技术发现近生理状态下的EP分子量约150 k D左右,呈单链形式,被胰蛋白酶激活后转变为含轻链和重链的双链形式。位于轻链的催化三联体突变（Asp-His-Ser）可导致EP催化活性丧失及表面电荷的改变。我们解析了非激活态、激活态、突变型、抑制剂结合型和底物结合型EP的高分辨率空间构象;其中非激活态EP核心区域空间构象的分辨率达2.7?,整体形貌显示SRCR、LDLR2和CUB2结构域环抱轻链;与非激活态相比,激活态EP的催化中心L1、L2和LD出现构象变化,且IVGG序列翻转了约180°;与抑制剂结合后EP核心区域围绕LCM结构域翻转了约120°,位于核心区域的LDLR2结构域重新定位并接触LCM结构域;底物参与的三维构象显示EP重链的CUB2结构域与底物相互结合。总之,轻链的N-末端诱导表面loop从非活性构象重塑为活性构象,从而产生高度动态的活性EP。EP重链发挥着类似于铰链的作用,确保轻链在底物识别及裂解方面的动态性。结论EP蛋白不同功能状态的空间构象变化及其与抑制剂和底物互作模式的分子机制模型,为EP结构-功能关系的研究奠定了基础。这些机制的发现为后期相关疾病的治疗及药物研发提供了线索,具有深远的病理生理学和治疗靶向意义。