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研究背景及目的胆囊癌（gallbladder cancer,GBC）是胆道系统最常见的恶性肿瘤,其发病机制至今未明。基因表观遗传的变化先于蛋白改变、细胞癌变的发生,从表观遗传学为切入点研究胆囊癌的发生发展机制,有助于了解胆囊癌发生的早期事件,为其早期诊断、早期治疗提供理论依据。Wnt通路抑制因子-1（Wnt inhibitory factor 1,WIF-1）,是一种重要的抑癌基因,是Wnt/β-catenin信号通路的拮抗分子之一。有研究表明,WIF-1启动子异常甲基化导致的WIF-1表达量减少促进了肿瘤的发生和进展。然而,WIF-1基因在胆囊癌发病机制中的作用尚未完全阐明,其调控机制也未见报道。课题组前期研究发现胆囊癌组织WIF-1蛋白表达降低,因此,本课题拟开展WIF-1启动子甲基化对WIF-1蛋白表达的影响及其机制的研究。方法与结果第一部分 胆囊癌WIF-1表达及其启动子甲基化状态研究方法:1)应用软件EMBOSS CpGPlot在线预测WIF-1基因启动子CpG岛。依此设计引物,甲基化特异性PCR（methylation specific PCR,MSP）分析50例胆囊癌组织、对照组20例慢性胆囊炎组织,以及胆囊癌NOZ、GBC-SD、SGC-996细胞WIF-1启动子甲基化状态。2)亚硫酸氢盐-克隆测序（bisulfate sequencing PCR,BSP）进一步验证胆囊癌WIF-1启动子甲基化状态。3)半定量RT-PCR、western blot检测胆囊癌细胞WIF-1表达水平。4)采用去甲基化试剂5-杂氮-2’-脱氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine,DAC）处理胆囊癌细胞,qPCR检测WIF-1 mRNA表达水平的变化。结果:1)在WIF-1启动子区域-562 nt～308 nt存在一个CpG岛,共19个CpG位点。MSP结果显示,胆囊癌组织WIF-1基因启动子甲基化阳性率（72.0%）显著高于慢性胆囊炎组织（25.0%）,χ2 =13.005,P<0.05。BSP结果显示,胆囊癌标本WIF-1启动子区域CpG位点甲基化比例（89.98%）显著高于慢性胆囊炎标本（71.58%）,t=2.596,P<0.05。2)在胆囊癌细胞NOZ、GBC-SD、SGC-996中,均未检测到WIF-1 mRNA、蛋白表达,且WIF-1启动子呈完全甲基化状态。在NOZ细胞中,WIF-1启动子区域CpG位点甲基化比例高达98.94%。DAC处理后72 h,胆囊癌细胞WIF-1 mRNA表达明显恢复（P<0.05）。第二部分WF-1甲基化状态与胆囊癌临床病理特征、预后的关系研究方法:收集50例胆囊癌患者的病例资料,卡方检验分析WIF-1甲基化与其临床病理特征的关系,预后单因素分析采用Kaplan-Meier法,组间比较选择Log rank检验,多因素分析采用Cox回归模型。结果:1)WIF-1甲基化与患者年龄、性别、合并胆囊结石与否、肿瘤病理分期（AJCC）、pT分期、淋巴结转移、远处转移、肿瘤类型、组织学分级等临床病理因素均无关系。2)单因素分析示,肿瘤病理分期、pT分期、淋巴结转移、远处转移、手术方式、WIF-1甲基化、血清CA19-9与预后有关（P<0.05）。WIF-1甲基化阳性组五年总生存率明显低于WIF-1甲基化阴性组（χ2=8.137,P<0.05）。3)多因素分析示,肿瘤病理分期、WIF-1甲基化是影响胆囊癌患者预后的独立危险因素（P<0.05）。第三部分c-Jun调控胆囊癌WIF-1表达的分子机制研究方法:1)免疫组化检测胆囊癌组织c-Jun蛋白表达情况,分析其与WIF-I蛋白表达的相关性。qPCR、western blot检测胆囊癌细胞c-Jun表达水平。2)设计合成三条siRNA序列,采用Lipofectamine 2000试剂转染NOZ细胞,并进一步筛选有效敲减c-Jun的干扰片段。3)qPCR、western blot检测NOZ细胞c-Jun沉默后,WIF-1表达水平的变化,BSP检测WIF-1启动子甲基化水平的变化。4)qPCR、western blot检测NOZ细胞c-Jun沉默后,DNA甲基化转移酶（DNA methyl transferases,DNMTs）表达水平的变化。5)免疫共沉淀用于寻找、验证与c-Jun相互作用的关键DNMT。结果:1)在50例胆囊癌组织标本同一蜡块连续切片中c-Jun蛋白高表达,而WIF-1蛋白低表达,两者表达水平负相关,Pearson r =-0.6213,P<0.05。2)c-Jun mRNA及蛋白在三株胆囊癌细胞均有表达,且NOZ细胞表达水平最高（P<0.05）。在设计合成的小干扰RNA片段中,P-3/siRNA敲减效率最高（P<0.05）。3)在NOZ细胞有效敲减c-Jun后,WIF-1表达恢复。c-Jun有效敲减株细胞WIF-1基因启动子区域CpG位点甲基化比例仅79.47%,与DAC处理组（74.73%）相似,与未处理组NOZ细胞（98.94%）相比明显降低（P<0.05）,表明在NOZ细胞有效敲减c-Jun后,WIF-1启动子去甲基化。4)有效敲减c-Jun造成DNMT1表达下调,而DNMT3a、DNMT3b表达无变化。5)c-Jun蛋白与DNMT1之间存在相互作用,而与DNMT3a、DNMT3b之间无联系。结论1)在胆囊癌细胞中,WIF-1基因启动子高甲基化可导致其低表达。2)WIF-1启动子甲基化是影响胆囊癌预后的独立危险因素,可以作为pTNM分期的有效补充。3)在胆囊癌中,c-Jun通过调控DNMT1的表达及与之相互作用,影响WIF-1启动子甲基化状态,从而调控WIF-1表达。