【目的】1.验证骨肉瘤细胞株CD133+亚群的生物学特性,探讨其与成球法之间联系,为骨肉瘤干细胞研究奠定基础。2.通过代谢组学方法筛选出骨肉瘤干细胞中主要改变的代谢通路。3.探讨骨肉瘤干细胞的线粒体代谢功能变化,寻求生物学特性改变相关的物质能量基础,为临床通过改变代谢途径治疗骨肉瘤提供新思路。4.通过蛋白质组学方法筛选出骨肉瘤干细胞中主要差异的蛋白,为骨肉瘤防治筛选出关键蛋白,寻求生物学特性改变相关的功能分子变化基础。5.验证蛋白质组学的准确性并探讨筛选出的转移相关蛋白ACTN4的作用。【方法】1.通过CCK-8、克隆形成试验、侵袭、化疗耐药试验、无血清悬浮培养成球实验等验证骨肉瘤CD133+细胞的增殖、存活、侵袭、耐药和成球能力,并用qPCR检测其干细胞相关基因表达。2.用色谱质谱联用的方法进行骨肉瘤干细胞代谢谱的非靶标鉴定,结合生物信息学方法探讨主要改变的代谢通路。3.通过流式细胞仪、电镜测定骨肉瘤干细胞的线粒体含量和微细结构,进一步用细胞代谢呼吸分析仪测定其线粒体代谢功能,再测定细胞中的ATP含量来验证。4.用无标记色谱质谱联用的方法进行骨肉瘤干细胞差异蛋白质筛选,结合生物信息学方法探讨主要改变的蛋白信号通路。5.采用蛋白免疫印迹和免疫组化技术分别检测关键蛋白ACTN4在骨肉瘤细胞不同亚群和骨肉瘤组织中的表达情况,并分析其与骨肉瘤临床病理因素之间的关系。【结果】1.相比骨肉瘤CD133-亚群细胞,CD133+细胞增殖迅速、克隆形成能力强、侵袭能力强、对阿霉素相对耐药、高表达干细胞相关基因Sox2与Nanog、在无血清悬浮培养下能很好成球。2.经代谢组学鉴定,与普通细胞相比骨肉瘤干细胞中有154个差异的化合物,进一步生物信息学分析发现相应代谢通路改变主要围绕线粒体展开包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路,精氨酸和脯氨酸代谢通路,谷胱甘肽代谢通路,半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路,柠檬酸循环通路。3.骨肉瘤干细胞线粒体探针的相对荧光强度大于普通细胞,电镜下见骨肉瘤干细胞中线粒体发育较成熟、直径相对较大、排列规整、形成长棒状或卷曲状的较多、而且线粒体内嵴的沟回较多较深;细胞代谢呼吸分析仪测定发现其能量表型相对位于坐标轴右上方、细胞外动态监测线粒体应激的参数都较高,细胞内ATP含量也较多。4.无标记差异蛋白质组学研究中,每个细胞样本均有超过6600个蛋白被检测到,差异超过1.5倍且有统计学意义的有124个蛋白,骨肉瘤HOS干细胞与非肿瘤干细胞差异蛋白集中最明显的是肿瘤转移相关通路,ACTN4蛋白位于通路关键节点。5.ACTN4在骨肉瘤干细胞中高表达,证实了蛋白质组学研究结果;在43例患者骨肉瘤组织标本中ACTN4高表达者发生远处转移的比例较高,与年龄、性别、发病部位、组织类型等无明显关联。【结论】1.在骨肉瘤细胞株中,CD133+亚群细胞增殖、克隆形成、阿霉素耐药、侵袭能力均明显强于CD133-亚群细胞;且高表达干细胞相关基因Sox2及Nanog,有较强形成干细胞球能力,这些特性证实了其可作为骨肉瘤干细胞模型。2.骨肉瘤干细胞与非骨肉瘤干细胞亚群之间存在代谢差异,主要代谢通路改变围绕线粒体展开包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路,精氨酸和脯氨酸代谢通路,谷胱甘肽代谢通路,半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路,柠檬酸循环通路。3.骨肉瘤干细胞的线粒体含量多于非骨肉瘤干细胞,且结构较成熟;骨肉瘤干细胞的线粒体代谢功能和ATP含量均高于非骨肉瘤干细胞,解释了骨肉瘤干细胞高增殖侵袭等特性的物质能量基础。4.采用的LC-MS非标记蛋白组学方法筛选出骨肉瘤HOS干细胞表达上调蛋白有93个,表达下调蛋白有31个,且差异蛋白主要集中于肿瘤转移相关信号通路,解释了骨肉瘤干细胞高侵袭转移特性的功能分子基础。5.ACTN4在骨肉瘤干细胞中广泛高表达,表明采取的蛋白质组学研究方法可靠;且在骨肉瘤患者组织标本中ACTN4高表达者发生远处转移的比例较高,提示其可当做骨肉瘤转移的预测因素。