【摘 要】
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目的:本研究首先对2019年西双版纳景洪市登革热疫情的感染人群进行分析,并对从感染DENV-1型别的登革热患者血清内提取测序得到的基因序列全长进行进化分析,探究登革病毒流行株的传入来源。同时从患者血清中分离出DENV-1和DENV-2野毒株通过梯度降温培养进行减毒,测序得到氨基酸突变位点,通过AG129幼鼠模型来分析经低温培养适应后的候选减毒株和野毒株的毒力变化。方法:对2019年云南省西双版纳景
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目的:本研究首先对2019年西双版纳景洪市登革热疫情的感染人群进行分析,并对从感染DENV-1型别的登革热患者血清内提取测序得到的基因序列全长进行进化分析,探究登革病毒流行株的传入来源。同时从患者血清中分离出DENV-1和DENV-2野毒株通过梯度降温培养进行减毒,测序得到氨基酸突变位点,通过AG129幼鼠模型来分析经低温培养适应后的候选减毒株和野毒株的毒力变化。方法:对2019年云南省西双版纳景洪市的登革热感染人数进行了统计分析。将1982年至2020年中国境内的登革病毒株使用RaxML软件绘制进化树后挑选具有代表性的登革病毒株进行进化树的构建。从版纳地区景洪市的登革热患者血清中提取登革病毒测全长序列,进行进化分析。使用C6/36细胞从临床患者血清中分离登革野毒株,转至Vero细胞上进行适应培养后纯化。将登革野毒株从37℃梯度降温至28℃进行减毒培养,保留在细胞上病变稳定的病毒株,得到DENV-1和DENV-2降温候选减毒株各一支。对候选减毒株进行基因全长测序,通过野毒株进行基因序列比对查找氨基酸突变位点。通过Vero病毒蚀斑辅助以BHK21细胞TCID50来鉴定病毒毒力和浓度。将浓缩纯化后的病毒稀释后皮下注射1x104PFU的量到两周龄AG129（IFN-αβγR-/-）幼鼠体内,检测每日体温和体重的变化。每两日处死一只幼鼠,进行病毒载量的Q-PCR相对定量检测以及其脾脏、肝脏和大脑进行病理检测分析。将第八日处死幼鼠的肝脏、脾脏和脑进行病毒载量的QPCR相对定量检测。结果:自2004年至2019年间中国境内共有93947人感染登革热,广东省和云南省是登革病毒株由境外输入的主要途经省份,且传入病毒序列存在一定差异。2019年云南西双版纳地区爆发了登革热大流行,DENV-1型感染和DENV-2型和DENV-3型感染在此次流行中同时存在,50份的病毒样本分型检测中有34例DENV-1型感染、15例DENV-2型感染和1例DENV-3型感染。选择占比最高的DENV-1进行序列分析,在全基因组的扩增及测序中,共获得8株DENV-1的全长基因序列。其中7株DENV-1流行株显示与缅甸、泰国、老挝等国家2019年的登革流行株亲缘关系相接近,同时与2015、2017年西双版纳傣族自治州景洪市的登革病毒流行株亲缘关系较远。从病人血清中提取得到的野毒株DENV-1和DENV-2与其相对应的梯度降温减毒后获得的候选减毒株相比,在氨基酸位点上都出现了 3个错义突变。将登革病毒浓缩纯化后测TCID50滴度为DENV-1野毒株（1.64x107PFU/ml）,DENV-1 候选减毒株（1.33x107PFU/ml）,DENV-2 野毒株（1.92x107PFU/ml）,DENV-2候选减毒株（1.01x107PFU/ml）。野毒株和候选减毒株感染AG129（IFN-αβγR-/-）幼鼠后,两个血清型野毒株和候选减毒株实验组幼鼠的体重变化存在显著性差异。全血病毒载量Q-PCR相对定量检测结果表明DENV-1和DENV-2野毒株和减毒株体内的病毒拷贝数变化存在区别,其最高病毒拷贝数的时间点不同。第八日的幼鼠器官中的相对病毒载量结果表明,幼鼠脾脏中的病毒拷贝数最高,肝脏较高,而大脑中病毒拷贝数低。病理切片结果发现脾脏的病理变化较小,但部分感染登革病毒的实验组幼鼠出现了脾脏肿大现象。肝脏损伤在病理切片上表现较为明显,DENV-1野毒株在炎细胞浸润、肝细胞排空方面均强于DENV-1候选减毒株。DENV-2减毒株对肝脏的造成的病理变化强于DENV-1型减毒株。与预期不同的是,DENV-2候选减毒株在AG129幼鼠体重减轻和导致幼鼠肝脏损伤方面的作用强于DENV-2野毒株。结论:境外输入登革病毒株是2019年西双版纳地区的登革热疫情爆发中的主要病毒流行株,传入方向为中南半岛的东南亚国家。2015、2017年景洪市登革热疫情的流行株并不是2019年登革热疫情的主要流行株。经降温减毒培养的DENV-1低温适应候选减毒株对幼鼠的毒力表现弱于野毒株,可认为降温减毒培养方式对登革病毒的毒力产生了一定影响,然而DENV-2候选减毒株尚有待进一步评价。
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