背景：肥胖不仅包括脂肪积聚的增加，还包括脂肪分布的异常。过多的脂肪积聚的增加，特别是内脏脂肪的增加，是多种代谢性疾病如2型糖尿病的高危因素。一系列研究已经证实：脂肪组织的储存部位和储存形式与肥胖相关性疾病关系密切。内脏脂肪组织无论在形态还是功能上都与皮下脂肪组织存在明显不同。同时，脂肪组织是一个巨大的内分泌器官，通过分泌脂肪细胞因子和炎症因子调节胰岛素敏感性和参与胰岛素信号通路。异位脂质沉积学说认为：由于皮下脂肪组织分化和分泌能力异常，过多的脂肪沉积于内脏脂肪组织、肝脏、胰腺和骨骼肌，导致胰岛素抵抗的发生发展。因此，深入研究内脏和皮下脂肪组织的分化和分泌情况，可为防治肥胖及其引起的胰岛素抵抗提供理论和实验依据。Caveolae是细胞膜上的特殊结构，在细胞信号转导中起着平台和枢纽作用，现已发现许多胰岛素信号转导通路中的信号分子集中或定位在Caveolae上，如：Src家族酪氨酸激酶、Ras/MAPK级联反应成员等。其标志蛋白caveolin是各种刺激因素进入胞内的起始环节，对信号转导起着“开关”作用，并在细胞增殖、分化、迁移、凋亡和血管生成等方面发挥重要作用。已有研究发现caveolin-1与T2DM病程密切联系。实验显示Caveolin-1基因敲除的小鼠无论给予何种饮食均会出现胰岛素抵抗，有学者提出胰岛素抵抗就是caveolin的异常。但是目前这部分研究主要集中在动物试验上，人体试验部分的研究报道尚不多，且结果不一致。临床上治疗糖尿病的药物中胰岛素和GLP-1受体激动剂对于体重有着不同的影响，而都能明显提高胰岛素敏感性，其机制尚不完全明确。我们团队早期研究发现，早期胰岛素强化治疗可以明显改善胰岛素抵抗，因此我们继续选用胰岛素作为干预药物研究其对于Caveolin-1的影响，同时选用同样可以改善胰岛素抵抗而且减轻体重的GLP-1受体激动剂（艾塞那肽）作为干预药物研究其影响机制。本研究的主要目的：①观察肥胖与正常体重者脂肪组织中Caveolin-1的表达，探讨Caveolin-1与体重以及HOMA-IR的关系；②建立人前脂肪细胞的原代培养模型，观察人前脂肪细胞分化成脂肪细胞过程中Caveolin-1表达的变化；③观察胰岛素、艾塞那肽体外干预人前脂肪细胞后，对其增殖、分化功能的影响以及Caveolin-1表达的变化，并初步探讨其改善胰岛素敏感性的影响机制。第一部分Caveolin-1在人皮下和网膜脂肪组织的差异表达及与肥胖和胰岛素抵抗的关系研究目的：探讨小凹蛋白1(Caveolin-1，CAV-1)在人皮下和网膜脂肪组织的差异表达，并分析其与肥胖及胰岛素抵抗的关系。对象和方法：一、研究对象按一定的纳入标准和排除标准筛选择期行腹部手术的女性患者41例。二、研究方法1、收集临床资料由研究者术前一天详细询问病史，并口头告知患者该项研究的目的和意义，取得患者的配合。收集患者身高、体重、腰围、臀围等人体测量学指标。2、所有患者空腹10小时后行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)，同时采集空腹采集静脉血，由检验科测定血糖、血脂、肝肾功能等生化指标。留取血清，同批ELISA法测定leptin、adiponectin、RBP4脂肪因子水平，化学发光法测定空腹胰岛素等指标。用稳态模型评估胰岛素抵抗指数（HOMA–IR）。3、于术中成对收集患者的皮下、大网膜脂肪组织，采用实时定量PCR法测定脂肪组织中Caveolin-1mRNA以及脂肪分化相关基因（PPAR-γ、C/EBP-α、Pref-1、RBP4、 adiponectin）mRNA的转录水平，采用Western Blot法测定相关基因的蛋白表达水平。4、统计学分析组内比较采用非配对t检验，组间比较采用ANOVA分析，不同变量间相关性检验采用Spearman检验和多元逐步回归分析。研究结果：1、研究对象临床资料本研究共入组41例，以体重指数BMI≥24kg/m2为切点分为二组：超重肥胖组(overweight group)12例；正常体重组（lean group）29例。2、两组患者的代谢指标及血清脂肪因子超重组患者血清FINS及HOMA-IR均高于正常体重组[FINS：(8.824±3.79)mU/L比(6.434±4.38)mU/L， P<0.05； HOMA-IR:(1.914±0.85)比(1.364±0.72)，P<0.05]。与正常体重组比较，超重肥胖组具有较高的leptin、RBP4和较低的adiponectin水平，差异有显著统计学意义(P<0.01)。3、两组间皮下、网膜脂肪组织Caveolin-1基因及蛋白表达水平的比较(1) Caveolin-1mRNA在两组皮下和网膜脂肪组织的表达：正常体重组网膜脂肪组织Caveolin-1mRNA的表达高于超重组(1.33±0.09比0.48±0.16，P<0.05)，但皮下脂肪组织Caveolin-1mRNA的表达在两组之间差异无统计学意义(0.64±0.62比0.14±0.22，P>0.05)。（2）Caveolin-1蛋白在两组皮下和网膜脂肪组织的表达的比较：正常体重组网膜脂肪组织Caveolin-1蛋白表达明显高于超重组(1.68±0.67比0.73±0.29，P<0.05)，而在皮下脂肪组织的表达两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。4、超重组与正常体重组皮下、网膜脂肪组织基因表达水平的比较在网膜脂肪组织，与正常体重组比较，超重组leptin，RBP4, PPAR-γ, C/EBP-α基因表达增加，adiponectin表达水平降低；在皮下脂肪组织，超重组Pref-1表达水平降低。提示脂肪因子水平与肥胖状态及脂肪分布部位密切相关。5、基因表达水平与血清脂肪因子及临床代谢指标的关系网膜脂肪组织Caveolin-1mRNA表达水平与BMI、腰围、甘油三酯、HOMA-IR均呈负相关(r分别为-0.441、-0.615、-0.539、-0.688，p<0.05)。而皮下脂肪组织Caveolin-1mRNA表达水平与BMI、腰围及HOMA-IR无明显相关关系(P>0.05)。结论：1、Caveolin-1在肥胖和正常体重者的网膜脂肪组织中存在差异表达。2、Caveolin-1在网膜脂肪组织的表达下调可能参与肥胖和胰岛素抵抗的发生。3、脂肪分化和脂肪细胞因子基因在皮下与网膜组织之间存在差异表达。4、脂肪分化和脂肪细胞因子基因表达的差异参与了肥胖及脂代谢异常的发生。第二部分人前脂肪细胞的原代培养及胰岛素的干预效应研究目的：建立人前脂肪细胞的原代培养模型，观察人前脂肪细胞增殖、分化的过程，并观察不同浓度胰岛素梯度对其分化的影响。研究方法1、人网膜前脂肪细胞的原代培养采用胶原酶分离法原代培养人网膜前脂肪细胞，体外扩增，并通过诱导分化及流式细胞术检测表明抗原进行鉴定。2、倒置显微镜下观察人前脂肪细胞在分化过程中形态方面的差异，MTT检测其者增殖的能力，油红O染色，RT-PCR及Western Blot法检测分化相关基因和蛋白的表达。3、分别采用0nm，0.1nm，1nm，10nm，100nm的胰岛素浓度干预人前脂肪细胞的分化过程，观察不同胰岛素浓度对其分化过程中相关基因表达及分泌情况的影响。4、观察不同干预对Caveolin-1表达的影响。5、观察不同干预对脂肪分化相关基因和蛋白表达的影响。6、观察不同干预对脂质合成和分解的影响。研究结果：1、成功地建立了人前脂肪细胞的原代培养模型，并在体外扩增，为下一步研究提供了细胞学研究平台。人前脂肪细胞呈梭形，类似成纤维细胞，其表面抗原表达也类似成纤维细胞，在体外可在培养基中诱导分化为脂肪细胞。2、MTT法检测结果示胰岛素抑制人前脂肪细胞增殖，而且其抑制效应随着胰岛素浓度的增加而有增加的趋势。3、油红O染色法检测结果示胰岛素促进人前脂肪细胞分化，而且其存进效应随着胰岛素浓度的增加而有增加的趋势。4、人前脂肪细胞分化为脂肪细胞过程前后Caveolin-1的表达水平无明显差异(P>0.05)。5、随着胰岛素浓度增加及时间推移，Caveolin-1表达逐渐增加(P<0.05)。6、随着胰岛素浓度的增加及时间的推移，甘油三酯以及甘油释放量均逐步升高。结论：1、人前脂肪细胞可从人脂肪组织获取并可在体外大量扩增。2、胰岛素干预人前脂肪细胞，抑制其增殖，促进其分化过程。3、人前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的过程对Caveolin-1的表达无明显影响。4、胰岛素作用于人前脂肪细胞，可上调其Caveolin-1的表达水平。第三部分艾塞那肽对人前脂肪细胞的干预效应研究目的：在上述研究的基础上，观察不同浓度艾塞那肽梯度对人前脂肪细胞分化的影响。研究方法：1、原代培养人网膜前脂肪细胞，并体外扩增。2、取4～10代的前脂肪细胞，分别采用0nm，0.1nm，1nm，10nm，100nm浓度的艾塞那肽干预人前脂肪细胞的分化过程，观察不同艾塞那肽浓度对其分化过程中相关基因表达及分泌情况的影响。3、观察不同干预对Caveolin-1表达的影响。4、观察不同干预对脂肪分化相关基因和蛋白表达的影响。5、观察不同干预对脂质合成和分解的影响。研究结果：1、MTT法检测结果示艾塞那肽促进人前脂肪细胞增殖，而且其促进效应随着胰岛素浓度的增加而有增加的趋势。2、油红O染色法检测结果示艾塞那肽抑制人前脂肪细胞分化，而且其抑制效应随着胰岛素浓度的增加而有增加的趋势。3、随着艾塞那肽浓度增加及时间推移，Caveolin-1表达逐渐增加(P<0.05)。4、随着艾塞那肽浓度的增加及时间的推移，甘油释放量逐步升高。结论：1、艾塞那肽干预人前脂肪细胞，促进其增殖，抑制其分化过程。2、艾塞那肽作用于人前脂肪细胞，可上调其Caveolin-1的表达水平。