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目的:通过慢病毒介导MMP-3shRNA和Fas-siRNA双基因体外转染人退变髓核细胞,探讨单基因、双基因联合转染后对人退变髓核细胞功能的影响。方法:a.体外培养人退变髓核细胞,对其进行台盼蓝染色、甲苯胺蓝染色,观察细胞活力以及细胞形态;b.分别根据人MMP-3基因与Fas基因的mRNA序列合成不同的MMP-3 shRNA与Fas-siRNA序列,与酶切后的慢载体链接并转入感受态293T细胞,对慢病毒进行包装。c.慢病毒感染退变髓核细胞,按照处理方式不同,本实验分为5组,分别为:A-空白对照组,B-AAV阴性对照组,C-AAV-MMP-3shRNA组,D-AAV-FassiRNA组,E-AAV-FassiRNA-MMP3shRNA组;d.转染72小时后CCK8测定各组之间的细胞增殖情况;72小时通过荧光定量PCR检测转染髓核细胞mRNA水平变化(MMP-3、Fas以及Ⅱ型胶原、蛋白多糖);96小时后通过Western Blot检测髓核细胞内蛋白水平变化(Ⅱ型胶原蛋白、蛋白多糖)。结果:a.细胞形态学进行观察发现初消化的成人退变髓核细胞贴壁时间约为4-5天,初贴壁时的形态表现为椭圆形、梭形、多角形,形状不规则,胞质向外伸突并随着时间延长逐渐伸长。经10-14 d以后,90%细胞呈融合状态,形状类似漩涡状或火焰状的细胞团,胞质丰富且带有一定折光性,细胞核较大轮廓清楚,呈卵圆形核,有大约1-3个核仁。经过传代后,第一代细胞之间的粘附性较原代变差,细胞形态变为长梭形,这与之前的研究相一致原代髓核细胞经甲苯胺蓝染色后呈短梭形、多角形等不规则形状,胞质均呈蓝色,细胞核位于细胞中央或偏向一侧细胞膜,颜色较周围胞质深。b.退变髓核细胞原代培养期间存活率在97%以上,第1代培养期间存活率在92-96%之间,第二代仍能维持90%左右,以后细胞存活率逐渐下降。c.72小时后用荧光显微镜检测重组慢病毒侵染人退变髓核细胞后的GFP、BFP表达情况,结果显示各组退变髓核细胞均已达到很高的转染效果。d.与空白对照组相比较,Fas干扰组、MMP3干扰组及MMP3+Fas双基因共转组Fas、MMP-3、II型胶原、蛋白多糖的mRNA表达量增加,且双基因组效果优于单基因组,与空白对照组相比较,Fas干扰组、MMP3干扰组及MMP3+Fas双基因共转组髓核细胞的蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白表达量增高,且双基因组效果优于单基因组,以上结果差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.通过基因沉默技术干扰髓核细胞内Fas、MMP-3基因的表达,可以有效抑制髓核细胞的凋亡,双基因共转染具有协同作用。2.慢病毒介导的RNAi可以显著抑制人退变髓核细胞MMP-3、Fas的表达,增加人退变髓核细胞外基质表达量,且双基因具有协同效应。