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本论文包括两个相对独立的研究内容,一是BRCA1调控复制偶联DNA双链断裂相关的基因组不稳定性研究;二是过表达核酸外切酶TREX2提高CRISPR成对切口酶基因编辑效率。研究课题一:乳腺癌作为全球第一癌症,已严重制约人类的生产生活。BRCA1作为乳腺癌防治检测中的明星分子,其基因突变与乳腺癌易感性密切相关。BRCA1功能缺陷将导致DNA损伤修复异常,这被认为是BRCA1缺陷型肿瘤发生发展的关键原因。细胞代谢产生广泛DNA单链断裂（single-strand breaks,SSBs）,也称为单链缺刻（nicks）,在DNA复制叉作用下转化为复制偶联DNA双链断裂（replication-coupled DSB）,此类DSB倾向利用同源重组（homologous recombination,HR）完成修复,而HR缺陷细胞中复制偶联DSB异常修复往往与染色体结构异常紧密相关,可能引起基因组不稳定性逐渐积累,最终导致细胞癌变。由于缺乏有效诱导复制偶联DSB损伤应答修复的研究方法,复制偶联DSB修复是否与BRCA1的功能相关联,这需要我们从分子机制上进行探索。在本研究中,我们利用CRISPR/Cas9切口酶突变体n Cas9（D10A/H840A）在DNA上诱导单链缺刻断裂,并期待着这些n Cas9诱导的SSB能够在复制叉冲撞下形成复制偶联DSB损伤,但数量稀少的复制偶联DSB并不利于检测和评估,因此我们利用在小鼠基因组中广泛分布的B2序列,设计单一sg RNA后便可在数万计的位点诱导复制偶联DSB。结果显示:（1）n Cas9可以有效诱导γH2AX和53BP1聚焦点共定位;（2）在复制抑制剂（阿非迪霉素、L-含羞草氨酸和羟基脲）作用下,n Cas9诱导的H2AX蛋白磷酸化程度相比野生型Cas9组明显降低。以上结果说明n Cas9诱导的SSB有相当数量转变成复制偶联DSB,再加上Cas9-sg RNA复合物在DNA断裂末端的长时间滞留特点,最终使n Cas9诱导的复制偶联DSB事件发生概率显著提高。在明确n Cas9可作为诱导复制偶联DSB的有效工具后,我们观察到,BRCA1缺陷细胞中复制偶联诱导的DSB会导致异常染色体结构增加和染色体间易位频率增高。明确BRCA1缺陷细胞中复制偶联DSB事件的修复结果评估后,我们采用以荧光信号表达与否来评估NHEJ/HR（非同源末端连接,non-homologous end joining,NHEJ）修复效率的报告系统结合n Cas9在报告系统上诱发复制偶联DSB,通过测定荧光信号来研究BRCA1在复制偶联DSB修复中的功能。实验结果表明复制偶联DSB修复呈现以下特点:（1）复制偶联DSB经NHEJ修复频率增加;（2）复制偶联DSB经HR修复频率降低;（3）后随链起源的复制偶联DSB偏向于利用长轨DNA合成完成HR修复;（4）53BP1的缺失能够部分拮抗BRCA1缺陷导致的复制偶联DSB的HR修复异常。综上所述,该研究通过解析在BRCA1缺陷下,复制偶联DSB修复异常转化为基因组不稳定性的具体方式,深入理解BRCA1在复制偶联DSB修复中作用以及与BRCA1缺陷型乳腺癌的突变特征的联系。这不仅可以完善我们对BRCA1缺陷与乳腺癌易感性相关性的理解,也为BRCA1突变型肿瘤基因组不稳定性提供新的参考。研究课题二:CRISPR/Cas9基因编辑技术凭借其简单、高效率和成本低廉等特点,已经发展成为现今生物科学研究领域的一项前沿技术。但是,随着该技术的推广应用,CRISPR系统的脱靶效应和编辑效率等技术问题也逐步凸显,尤其是突出的脱靶效应限制了该技术在临床上的应用。前期研究表明,通过将Cas9核酸酶两个功能结构域点突变,就能够获得切割单链DNA突变体,统称为单链切口酶;利用配对切口酶可以有效地降低Cas9核酸酶脱靶效率。然而实际应用中,利用单链断裂修复来实现基因编辑的效率普遍偏低,特别是切割产生3’外伸末端后更显著。研究发现TREX2作为一种可以加工3’外伸末端的核酸外切酶,在过表达TREX2前提下,经I-Sce I切割产生的3’外伸末端在修复过程中更容易发生错误,从而提高靶向基因组破坏效率。本项目中,我们利用成对Cas9切口酶技术在基因组诱导3’外伸末端且结合TREX2过表达,期望可以提高靶向位点编辑效率且不影响编辑精准度。结果发现:（1）在以荧光信号表达与否代表编辑效率的系统上利用成对Cas9切口酶诱导产生3’外伸末端在TREX2过表达情况下,编辑效率相比正常组可以提高4-20倍;（2）深度测序分析成对Cas9切口酶在鼠源Rosa26位点诱导3’外伸末端发现,对比正常组TREX2过表达后可以提高编辑效率20倍;（3）过表达TREX2通过促进对3’外伸末端的加工来提高促编辑效率;（4）TREX2过表达不影响Rosa26位点的脱靶效应;（5）TREX2对短3’外伸末端有更好促编辑效果;（6）TREX2对成对Cas9切口酶产生外伸端的促编辑作用依赖NHEJ途径修复。综上所述,该研究通过将TREX2与成对Cas9切口酶技术相结合,提供了一种在细胞中有效研究3’外伸末端工作效率的方法,为CRISPR基因编辑技术的应用提供了新思路。