背景:我国已成为世界上最大的铜加工材生产国,大量采矿、工业废水排放、污水灌溉等人类活动使我国铜污染问题日益加重。部分地区铜含量远超过环境容量。环境介质中铜含量的增多极大地增加了人群接触的机会,环境暴露风险日益增强。众多研究表明,铜代谢失衡与神经退行性疾病的发生发展密切相关。但目前,针对铜神经毒性的相关研究相对较少,其具体机制仍不清楚。因此,探讨铜暴露的神经毒性机制具有重要意义。目的:本研究以秀丽线虫为研究对象,探究氧化应激在铜致神经损伤中的作用及其分子机制,为评估铜暴露健康风险和开展相关研究提供科学依据。方法:本研究根据实验目的不同选择相应虫株进行相关实验,所用虫株铜染毒剂量均为0.01,0.1,1和10mg/L,染毒时间均从L4期幼虫染毒至成虫期。1.铜对秀丽线虫神经系统的影响通过体视显微镜观察N2线虫头部摆动频率、身体弯曲频率、咽泵频率、排便速率、化学趋向性实验等指标从神经行为学角度反映铜暴露所致的神经毒性效应;在荧光显微镜下观察BZ555、EG1285、LX929和DA1240等虫株神经元结构并定量神经元细胞荧光强度,评价铜对报告基因虫株神经元的影响;并采用RT-q PCR技术检测铜是否可以影响N2线虫谷氨酸、五羟色胺和多巴胺等神经递质的的基因转录水平。2.铜对秀丽线虫氧化应激水平的影响通过H2DCFDA探针、JC-1探针和RT-q PCR技术分别检测N2线虫体内ROS水平、线粒体膜电位以及SOD和GSH-Px相关基因的表达水平;并采用荧光显微镜观察报告基因虫株CF1553来反应SOD-3蛋白的表达水平从而来探讨氧化应激在神经损伤中的作用。3.p38 MAPK信号通路靶向SKN-1/Nrf2调控铜致秀丽线虫神经损伤通过体视显微镜观察KU25（编码MAPK的pmk-1基因突变株）的头部摆动频率、咽泵频率、排便速率等指标并且在荧光显微镜下观察LD1虫株的SKN-1核转移情况等来分析铜是否通过p38 MAPK信号通路调节SKN-1/Nrf2诱导氧化损伤,从而导致神经功能障碍。结果:1.铜对秀丽线虫神经系统的影响1.1铜对秀丽线虫神经行为损伤的确定（1）各染毒组N2线虫身体弯曲和头部摆动频率与对照组差异均有统计学意义,均随着铜染毒浓度增加而降低（P<0.01）。（2）0.1mg/L组、1mg/L组和10 mg/L组N2线虫随着铜染毒浓度的升高咽泵频率逐渐减慢,与对照组相比,差异均有统计学意义（P<0.01）。（3）随着铜染毒浓度的增加,N2线虫排便时间间隔逐渐延长,排便速率逐渐降低。各处理组与对照组相比,差异均有统计学意义（P<0.01）。（4）随着铜染毒浓度的增加,N2线虫的化学趋向指数逐渐变小。1mg/L组和10 mg/L组趋向指数变为负值,与对照组相比,差异均有统计学意义（P<0.01）。1.2铜对秀丽线虫神经元和突触的损伤（1）与对照组相比,0.01mg/L组、0.1 mg/L组和1mg/L组线虫的谷氨酸能神经元（Glutamate,GLU,DA1240）头部神经环荧光面积与荧光强度均没有发生变化,差异无统计学意义（P>0.05）,而10 mg/L组线虫头部神经环荧光面积和荧光强度则明显降低,差异有统计学意义（P<0.01）。（2）各染毒组受试虫株γ-氨基丁酸能神经元（γ-aminobutyric acid,GABA,EG1285）均出现不同程度的断裂、缺失,高浓度组神经元断裂、缺失程度高于低浓度组。与对照组相比,铜染毒后GABA能神经元荧光强度随着染毒浓度的增高逐渐降低,差异均有统计学意义（P<0.01）。（3）各染毒组受试虫株胆碱能神经元（Acetylcholine,Ach,LX929）均出现不同程度的断裂、缺失,其中,高浓度组神经元断裂、缺失更为严重。与对照组相比,各染毒组胆碱能神经元荧光强度均减弱,差异均有统计学意义（P<0.01）。（4）与对照组相比,铜染毒组头部多巴胺能神经元（Dopamine,DA,BZ555）荧光面积有所减少,高浓度组较低浓度组更为明显。各染毒组多巴胺能神经元荧光强度与对照组相比均降低,差异均有统计学意义（P<0.01）。（5）铜染毒后,谷氨酸转运蛋白和谷氨酸受体相关基因表达量与对照组相比均出现了不同程度的降低,差异有统计学意义（P<0.01）;多巴胺转运蛋白和多巴胺受体相关基因表达均不同程度地下调,差异有统计学意义（P<0.01）;五羟色胺转运蛋白和五羟色胺受体相关基因表达量与对照组相比均出现了不同程度的降低,差异有统计学意义（P<0.01）。2.铜对秀丽线虫氧化应激水平的影响2.1铜对秀丽线虫ROS和线粒体氧化损伤水平的影响（1）随着铜染毒浓度的增加,N2线虫ROS水平逐渐升高。各处理组与对照组相比,差异均有统计学意义（P<0.01）。（2）铜染毒后,N2线虫线粒体受损,线粒体膜电位下降。各处理组与对照组相比,差异均有统计学意义（P<0.01）。2.2铜对秀丽线虫抗氧化酶表达水平的影响（1）铜染毒后,N2线虫GSH-Px相关基因与对照组相比均出现不同程度下调,差异有统计学意义（P<0.01）。（2）铜染毒后,N2线虫SOD相关基因与对照组相比均出现了不同程度下调,差异有统计学意义（P<0.01）。（3）CF1553其绿色荧光强度代表线虫体内SOD-3蛋白表达水平。铜染毒后,线虫绿色荧光面积逐渐减少,与对照组相比,各剂量组平均荧光强度减弱,差异有统计学意义（P<0.01）。即染毒后,线虫体内SOD-3蛋白表达水平逐渐降低。3.p38 MAPK信号通路靶向SKN-1/Nrf2调控铜致秀丽线虫神经损伤3.1 p38 MAPK通路在铜致神经损伤中的作用（1）自然条件下,KU25的头部摆动频率低于N2,二者差异有统计学意义（P<0.01）;10 mg/L铜染毒后,与对照组相比,N2线虫头部摆动频率明显下降,二者差异有统计学意义（P<0.01）。而KU25头部摆动频率没有发生明显变化,与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。（2）自然条件下,KU25的咽泵频率低于N2,差异有统计学意义（P<0.01）。10 mg/L铜染毒后,N2咽泵频率明显变慢,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）;相反,KU25染毒后咽泵频率并没有出现明显减慢现象,与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。（3）自然条件下,KU25排便速率低于N2,差异有统计学意义（P<0.05）;10 mg/L铜染毒后,N2线虫与对照组相比排便速率降低,差异有统计学意义（P<0.01）;而KU25与对照组相比排便速率相近,差异无统计学意义（P>0.05）。3.2铜通过p38 MAPK信号通路促进SKN-1核转移（1）随着铜染毒浓度的增加,N2线虫skn-1基因表达量逐渐升高,各染毒组与对照组相比,差异均有统计学意义（P<0.01）。（2）铜染毒后,SKN-1蛋白在线虫肠道细胞核出现明显积累,与对照组相比,差异有统计学意义（P<0.01）。（3）经10 mg/L铜染毒后,N2线虫与对照组相比,ROS水平升高,差异有统计学意义（P<0.01）;而KU25与对照组相比ROS水平没有发生明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）。（4）铜染毒后,N2线虫skn-1基因表达上调,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）;相反,KU25染毒后skn-1基因表达量没有出现明显变化,与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.铜可导致秀丽隐杆线虫神经行为缺陷、神经元受损并且影响神经递质的正常传导和接收,铜具有神经毒性作用。2.铜可导致线虫体内ROS增加,线粒体受损,并抑制抗氧化酶的表达,从而使得机体氧化应激水平升高。3.铜可能通过p38 MAPK信号通路调节SKN-1/Nrf2诱导氧化损伤,从而导致神经功能障碍。