论文部分内容阅读
目的:探究层粘连蛋白α5（Laminin Subunit Alpha 5,LAMA5）激活Notch通路调控上皮-间充质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）促进上皮性卵巢癌（Epithelial Ovarian Cancer,EOC）侵袭、迁移的机制,为EOC的靶向治疗提供新思路。方法:（1）研究对象:以2010年10月-2020年5月在石河子大学医学院第一附属医院手术确诊的145例EOC患者为研究对象,收集其临床病理资料,排除标准:（1）资料不完整（19例）者;（2）手术前接受过化疗者（14例）;（3）非卵巢原发者（25例）;最终入组87例。（2）收集入组EOC患者的临床病理信息:包括诊断时年龄,FIGO分期（2014）,组织学分型,CA125值,有无淋巴或脉管癌栓,淋巴结是否转移。（3）患者随访及预后分析:按NCCN指南（2021版）对患者进行随访,随访到70人,失访17人,随访截止时间为2022年3月30日。患者者生存时间（Overall survial,OS）即手术日期至患者死亡时间或者随访截止时间。生存结果采用Kaplan-Meier法计算,采用Cox比例风险模型分析多种预后因素对患者OS的影响。（4）将87例EOC组织行免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）染色,将肿瘤细胞按阳性细胞比例和着色强度评分,最终分数为强度分数和百分比分数的乘积。对照组选取30例正常输卵管伞端上皮（取自因子宫肌瘤,子宫腺肌病或者卵巢良性肿瘤而行子宫+双附件切除的女性患者）,采用卡方检验和连续性校正分析入组EOC的LAMA5蛋白表达水平与其临床病理特征的相关性。（5）慢病毒转染下调OC细胞株SKOV3和A2780的LAMA5表达,转染空载体的OC细胞为对照;分别使用Ed U与Transwell侵袭迁移实验检测其增殖、侵袭和迁移能力。（6）通过嘌呤霉素筛选出稳定下调LAMA5的细胞株（sh LAMA5）,分别构建裸鼠皮下异种移植瘤与腹腔种移植模型,观察裸鼠皮下成瘤体积及腹腔转移情况;（7）通过体内外实验验证LAMA5表达水平下调是否抑制EMT。（8）利用Linked Omics数据库预测LAMA5相关信号通路,检测发现LAMA5的表达与Notch信号通路显著相关。将Notch1抑制剂Tangeretin加入完全培养基中处理细胞,并将此作为实验组,对照组分为DMSO溶剂对照与空白处理组。分别使用Ed U与Transwell侵袭迁移实验检测其增殖、侵袭和迁移能力变化;免疫印迹实验和IHC染色检测Notch信号通路相关因子蛋白表达情况。结果:（1）与正常输卵管上皮细胞相比,EOC癌组织的肿瘤细胞中LAMA5表达显著升高（X~2=40.629,p=0.000）,癌细胞中LAMA5表达与患者CA125水平和FIGO分期有显著相关关系（p＜0.05）;多因素Cox模型显示LAMA5蛋白高表达（p=0.039）,年龄≥55岁（p=0.001）和FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期（p=0.004）是EOC患者生存相关变量和独立危险因素。（2）与对照组相比,抑制LAMA5的表达可以显著降低OC细胞株的增殖、侵袭和迁移水平（p＜0.05）;（3）裸鼠皮下异种移植模型表明,稳定下调LAMA5组细胞形成的肿瘤体积小,与NC组相比肿瘤体积有显著统计学差异（p＜0.05）。每周在裸鼠腹腔注射荧光素酶后通过活体成像仪观察其体内成瘤与转移情况,结果表明与注射LV-NC细胞组相比,注射LV-sh LAMA5细胞的裸鼠肿瘤腹腔成瘤与转移能力下降（p＜0.05）。（4）OC细胞株SKOV3和A2780中的WB实验结果显示,LAMA5下调组较对照组,E-cadherin表达水平上调,N-cadherin和Vimentin表达水平低（p＜0.05）。裸鼠皮下瘤切片IHC染色结果也证实E-cadherin表达水平上调,N-cadherin和Vimentin表达水平低。（5）与DMSO溶剂与空白对照组相比,Notch1抑制剂可以显著降低SKOV3和A2780的增殖、侵袭和迁移水平（p＜0.05）;WB和IHC结果显示,与空载体对照组相比,下调LAMA5后OC细胞Notch1、Notch3和Hes1表达水平显著降低（p＜0.05）。结论:（1）LAMA5蛋白在EOC组织中的表达高于正常输卵管伞上皮组织,高表达LAMA5是EOC患者生存相关变量和独立危险因素;（2）体内外实验证实LAMA5可以促进OC细胞的增殖、侵袭和迁移及肿瘤的生长和转移;（3）LAMA5可能通过Notch信号通路影响EMT,促进EOC的恶性进展。