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研究背景膝骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是临床常见病、多发病,其病理变化主要有软骨退变、骨质增生和滑膜病变等,进而导致关节疼痛、肿胀等症状,严重影响患者的膝关节功能,给家庭和社会带来沉重的负担。目前临床治疗OA的方法众多,但大多都是对症治疗,探讨从发病机制层面进行治疗一直都是学者关注的热点内容。尽管OA的确切发病机制尚不明确,但是目前的研究和大多数学者都接受的观点是:炎症因子广泛参与疾病进程、导致软骨损伤是OA的发病机制之一。细胞焦亡是一种特殊的细胞程序性死亡方式,细胞焦亡与OA均有大量炎症细胞因子释放,比如IL-1β、IL-18、TNF-α和TGF-β等因子,细胞焦亡相关信号通路中的NLRP3、caspase-1、IL-18和IL-1β均在其中发挥重要的作用。最近的研究显示,细胞焦亡参与OA的发生和进展,抑制NLRP3和caspase-1介导的焦亡可减轻OA损伤。因此,本研究聚焦骨髓间充质干细胞（BMSC）来源外泌体miR-326抑制软骨细胞焦亡、减轻骨关节炎软骨损伤的机制研究,可能为临床治疗OA软骨损伤提供新的治疗思路。研究目的综合上述研究背景和前期工作基础,本研究拟对骨髓间充质干细胞（BMSC）来源的外泌体miR-326通过组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）抑制软骨细胞焦亡、减轻软骨损伤的作用和机制进行研究,探讨通过抑制软骨细胞焦亡治疗OA的可能性,为临床治疗OA软骨损伤提供新的思路和途径。研究方法下列（1）是临床研究方法,（2）-（10）是基础研究方法,其中（2）-（9）是软骨细胞水平研究方法,（10）是大鼠动物水平研究方法。1收集14例行全膝关节置换术的膝关节软骨标本（膝关节K-L分级Ⅳ级）作为病变组,5例因小腿毁损伤而行股骨远端截肢患者的膝关节软骨作为对照组;同时分别取所有患者的外周静脉血标本。通过血液学指标测量、形态学组织检查,研究OA患者的软骨细胞焦亡情况。（2）分离培养大鼠膝关节软骨细胞、并进行软骨细胞的鉴定和培养。（3）分离鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,提取BMSCs中的外泌体,测量外泌体直径、观察形态、检测标记分子（CD9、CD63、CD81）的表达。（4）将BMSCs-Exos和OA大鼠软骨细胞共培养,采用WB、PCR、ELISA和免疫荧光等方法,检测软骨细胞的活力和迁移能力、软骨特异性基因（COL2A1、SOX9、Agg和Prg4）的表达、软骨细胞中GSDMD和cleaved caspase-1的水平、caspase-1的活性、细胞炎症因子（IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α）的含量和软骨焦亡相关蛋白（NLRP3、ASC、GSDMD p30、caspase-1 p20、IL-18和IL-1β）的表达。目的是为了研究BMSCs-Exos对OA软骨细胞的影响。（5）采用免疫荧光标记（PKH26）和PCR技术,确定BMSCs-Exos能否传递miR-326至软骨细胞,以及BMSCs-Exos能否增加OA大鼠软骨细胞中miR-326水平。（6）构建miR-326模拟物和抑制剂,转染到BMSC中并提取外泌体,然后将外泌体和OA大鼠软骨细胞共培养。采用WB、PCR、ELISA和免疫荧光等方法,检测软骨细胞活力和迁移能力、细胞炎症因子（IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α）含量、软骨细胞中GSDMD和cleaved caspase-1的水平、软骨焦亡相关蛋白（NLRP3、ASC、GSDMD p30、caspase-1 p20、IL-1β和IL-18）的表达,检测miR-326、HDAC3、COL2A1、SOX9、Agg和Prg4的转录水平,检测NF-κB p65和caspase-1的活性,检测HDAC3、STAT1、乙酰化STAT1、NF-κB p65和乙酰化NF-κB p65等指标。目的是为了研究BMSCs-miR-326-Exos对OA软骨细胞的影响。（7）在上述研究的基础上,我们用miR-326模拟物和HDAC3过表达载体（HDAC3OE）转染OA软骨细胞,在BMSCs细胞促进miR-326基础上促进HDAC3蛋白过表达,重复步骤（6）中的指标检测。目的是为了研究HDAC3过表达对OA软骨细胞的影响。（8）双荧光素酶法检测miR-326结合HDAC3 3’-UTR的具体位点。（9）使用miR-326抑制剂和HDAC3、STAT1抑制剂处理OA大鼠软骨细胞,并建立对照组,重复步骤（6）中的指标检测。目的是为了研究软骨细胞中miR-326和caspase-1之间的相互作用,明确HDAC3和STAT1信号通路抑制剂对OA软骨细胞焦亡的影响。（10）构建OA模型大鼠,进行大鼠体内实验,采用ICRS评分、HE和Safranin-O/fast green染色等评价软骨组织学形态,并重复步骤（6）中的各项指标检测。研究BMSCs-miR-326-Exos对大鼠体内软骨细胞焦亡的影响。研究结果下列（1）是临床研究结果,（2）-（7）是基础部分之细胞水平研究结果,（8）是基础部分之动物水平研究结果。1临床研究显示,病变组（膝关节OA患者）外周血中caspase-1和IL-18的含量高于对照组,差异有统计学意义;通过形态学TUNEL染色,发现病变组软骨存在明确的软骨细胞焦亡现象,半定量统计学分析显示,两组间差异有统计学意义。2 BMSCs-Exos对大鼠软骨细胞影响的研究结果。OA软骨细胞的活力和迁移能力、软骨特异性基因（COL2A1、SOX9、Agg和Prg4）的转录均低于正常软骨细胞,但caspase-1活性、细胞炎症因子（IL-18、IL-1β、IL-6和TNF-α）含量、软骨细胞中GSDMD和cleaved caspase-1水平、软骨焦亡相关蛋白（NLRP3、ASC、GSDMD p30、caspase-1 p20、IL-18、和IL-1β）的表达均高于正常软骨细胞。BMSCs-Exos能增加OA软骨细胞活力和迁移能力、软骨特异性基因（COL2A1、SOX9、Agg和Prg4）的转录,降低caspase-1活性,降低细胞炎症因子（IL-18、IL-1β、IL-6和TNF-α）含量,降低软骨细胞中GSDMD和cleaved caspase-1水平,降低软骨焦亡相关蛋白（NLRP3、ASC、GSDMD p30、caspase-1 p20、IL-1β和IL-18）的表达。（3）免疫荧光标记和PCR显示,BMSCs-Exos传递miR-326至软骨细胞,BMSCs-Exos增加OA软骨细胞中miR-326水平。（4）BMSCs-miR-326-Exos对大鼠软骨细胞影响的研究结果。BMSCs细胞促进miR-326后,其外泌体增加OA软骨细胞活力和迁移能力;降低炎症因子（IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α）含量,降低软骨细胞中GSDMD和cleaved caspase-1水平,降低caspase-1和NF-κB p65活性,降低软骨焦亡相关蛋白（NLRP3、ASC、GSDMD p30、caspase-1 p20、IL-1β和IL-18）的表达;促进miR-326和软骨特异性基因（COL2A1、SOX9、Agg和Prg4）转录,抑制HDAC3转录,提高乙酰化STAT1、乙酰化NF-κB p65和STAT1蛋白表达,降低HDAC3蛋白和NF-κB p65表达。BMSCs细胞抑制miR-326后,则表现出相反结果。（5）使用miR-326模拟物和HDAC3过表达载体转染OA软骨细胞的研究结果。过表达miR-326,提高OA软骨细胞的活力和迁移能力,提高软骨特异性基因（COL2A1、SOX9、Agg和Prg4）的转录,降低caspase-1和NF-κB p65活性,降低细胞炎症因子（IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α）含量,降低软骨细胞GSDMD和cleaved caspase-1水平,降低软骨焦亡相关蛋白（NLRP3、ASC、GSDMD p30、caspase-1 p20、IL-1β和IL-18）的表达,提高乙酰化STAT1、乙酰化NF-κB p65和STAT1蛋白表达,降低HDAC3蛋白和NF-κB p65表达。过表达HDAC3蛋白（HDAC3OE）,可抵消miR-326模拟物的作用,表现出相反结果。（6）双荧光素酶检测结果显示miR-326结合HDAC3 3’-UTR的位点。（7）使用HDAC3和STAT1抑制剂,研究miR-326对软骨细胞焦亡的影响。结果显示:miR-326抑制软骨细胞caspase-1表达,使用miR-326抑制剂能增加caspase-1表达。使用HDAC3抑制剂Trichostatin A或者STAT1抑制剂AG490,能够抑制miR-326抑制剂诱导的软骨细胞中GSDMD和active caspase-1的增加,能够抑制miR-326抑制剂导致的的软骨细胞炎症因子（IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α）含量的增加,能够抑制miR-326抑制剂导致的软骨焦亡相关蛋白（NLRP3、ASC、GSDMD p30、caspase-1 p20、IL-1β和IL-18）水平的升高。（8）OA大鼠体内实验研究结果。OA组软骨ICRS评分显著低于假手术组,OA+BMSCs-Exos组和OA+BMSCs-miR-326-Exos组的ICRS评分都高于OA组。HE和Safranin-O/fast green染色均显示,OA组软骨厚度降低、软骨细胞数量减少、细胞排列紊乱,OA+BMSCs-Exos组和OA+BMSCs-miR-326-Exos组的软骨组织学表现明显优于OA组。相比假手术组,OA组miR-326和软骨细胞特异性基因（COL2A1、SOX9、Agg和Prg4）转录减少、HDAC3转录增加,细胞因子（IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α）含量增加,软骨焦亡相关蛋白（NLRP3、ASC、GSDMD p30、caspase-1p20、IL-1β和IL-18）表达增加,NF-κB p65和caspase-1活性增加,软骨细胞中GSDMD和cleaved caspase-1水平升高,HDAC3蛋白和NF-κB p65表达增加,乙酰化STAT1、乙酰化NF-κB p65和STAT1蛋白表达降低。OA+BMSCs-Exos组和OA+BMSCs-miR-326-Exos组则逆转了OA组的这种变化趋势。研究结论（1）临床研究表明,晚期OA患者膝关节软骨中存在软骨细胞焦亡现象。（2）大鼠体外软骨细胞研究显示,BMSCs-Exos可以将miR-326传递到软骨细胞,BMSCs-miR-326-Exos能够抑制软骨细胞焦亡、维持软骨细胞稳态;初步研究显示调控机制是miR-326靶向结合HDAC3 3’-UTR的位点,通过HDAC3和STAT1/NF-κB p65通路抑制软骨细胞焦亡。（3）OA大鼠动物体内实验研究显示,BMSC来源的外泌体miR-326能抑制大鼠软骨细胞焦亡、减轻OA软骨损伤。（4）上调外泌体miR-326水平,通过组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）抑制软骨细胞焦亡、减轻骨关节炎软骨损伤,可能为临床治疗OA提供新的思路。