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肝脏是人体重要的器官之一,具有代谢、糖原储存、药物解毒、胆汁分泌等广泛的功能。肝功能对于体内平衡至关重要,手术,创伤,药物等会造成肝脏损伤,并导致肝功能受损甚至死亡。而肝组织结构中80%的肝细胞,是肝功能的主要执行者,也是缺血缺氧应激损伤的靶细胞。肝细胞中富含线粒体,当细胞受到氧化应激损伤时会造成线粒体损伤,改变线粒体通透性和膜电位,进而诱发细胞凋亡。因此,肝细胞线粒体损伤及凋亡在缺血缺氧引起的肝脏疾病中发挥关键作用。骨髓间充质干细胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSC）是骨髓来源的多功能干细胞,具有分化为多种细胞的潜力,可用于治疗肝脏疾病,但干细胞治疗可引起栓塞、异常分化及肿瘤形成等潜在风险。近来诸多研究认为BMSCs主要通过旁分泌机制调节免疫反应,下调局部炎症损伤。其中BMSC来源的外泌体（exosomes）是旁分泌的重要成分,在细胞通讯中发挥重要作用。外泌体（exosomes）是由细胞分泌的直径在40-150nm的囊状膜泡,其中富含蛋白和RNA,尤其是miRNAs,具有低免疫原性,生物相容性等优势,可以对细胞增殖、迁移、凋亡等多种生物学进程进行调控。富含半胱氨酸蛋白61（Cellular Communication Network Factor 1,CCN1）作为一种细胞基质蛋白,可以参与细胞增殖,分化,凋亡等过程,当细胞损伤发生时,往往伴随CCN1水平升高,不同类型细胞中CCN1可通过激活线粒体途径及TNF-α受体途径激活凋亡。但BMSC来源的exosomes在缺氧性肝细胞损伤中的作用机制,尤其是与CCN1在肝细胞线粒体损伤及凋亡中的作用方式尚未阐明,因此本文将重点研究BMSC来源的exosomes通过降低CCN1减轻氧化应激状态下肝细胞线粒体损伤及凋亡的具体机制,为缺血等缺氧肝损伤的治疗提供新的治疗策略。我们用过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）诱导肝细胞株L02建立肝缺氧损伤模型。首先确定BMSC分泌的exosomes是否对肝细胞具有保护作用。收集BMSC的培养基上清与L02细胞在缺氧条件下共孵育,发现BMSC培养上清能减轻细胞凋亡,保护线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）,降低活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平。随后用exosomes分泌抑制剂-GW4869处理BMSC并收取上清,重复上述实验,结果显示BMSC上清对肝细胞的保护作用消失。最后通过超速离心提取BMSC培养上清中的exosomes并重复上述实验,发现exosomes对细胞同样具有保护作用。为分析exosomes保护肝细胞的分子机制,通过转录组测序对BMSC exosomes处理的缺氧肝细胞、单纯缺氧肝细胞及常氧培养肝细胞中差异表达的基因进行了筛选,并通过DAVID数据库对显著差异表达基因进行生物信息学分析,将响应缺氧诱导并受BMSC exosomes调节,且参与肝细胞凋亡的最佳候选基因初步锁定为CCN1。进一步运用Real time-PCR对测序结果进行确认,发现CCN1在正常细胞中的表达量很低,当H2O2/缺氧刺激细胞后明显升高,而exosomes能够显著抑制氧化应激导致的CCN1升高。为进一步研究exosomes发挥保护功能是否通过CCN1介导,我们构建CCN1稳转细胞系,发现CCN1过表达（CCN1-over expression）不但会加重H2O2/缺氧诱导的肝细胞凋亡,而且会完全阻断BMSC来源exosomes的缺氧肝细胞保护效应;降低CCN1表达（sh-CCN1）能显著减轻H2O2/缺氧诱导的肝细胞凋亡,BMSC来源exosomes对低表达CCN1 L02细胞的保护作用亦不明显。上述结果说明BMSC exosomes通过降低缺氧诱导的CCN1减轻肝细胞凋亡。我们还通过生物信息学对BMSC exosomes中富含的miRNAs调控CCN1表达的可能机制进行了初步分析。对已发表文献的BMSC exosomes miRNAs测序数据二次分析,筛选出可能负调控CCN1且在exosomes中富集的miR-22-3p。但具体调控机制还需后续实验验证。为了探究缺氧时CCN1转录水平升高的机制,通过Animal TFDB数据库和L02细胞转录组测序结果取交集筛选出可能结合CCN1启动子的转录因子锌指和含有7B的BTB结构域（Zinc Finger And BTB Domain Containing 7B,ZBTB7B）,初步验证缺氧能够促进ZBTB7B的表达,与CCN1变化一致;且exosomes能够使ZBTB7B m RNA和蛋白水平下降,提示exosomes可能通过抑制ZBTB7B对CCN1表达进行调控。综上所述,BMSC exosomes通过降低缺氧诱导的CCN1表达,减轻氧化应激状态下肝细胞线粒体损伤及凋亡。生物信息学分析提示BMSC来源exosomes一方面可能向肝细胞转运miR-22-3p,后者具有靶向抑制CCN1表达的潜能;另一方面,exosomes还可能通过抑制缺氧肝细胞转录因子ZBTB7B的表达来降低CCN1表达,二者共同作用,实现减轻H2O2/缺氧诱导的线粒体损伤和细胞凋亡的功效。