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红曲菌作为中国传统食品的发酵用菌,是目前世界上唯一被批准可用于生产可食用色素的重要微生物,橙色红曲菌可以产生众多对人体有益的次级代谢产物,如红曲色素、Monacolin K、γ-氨基丁酸以及麦角甾醇等,使其具有降血脂、降血压、抗菌、抗癌等功能。但是橙色红曲菌同时也产生一种真菌毒素桔霉素,这也使橙色红曲菌的应用受到了很大的限制。在真核细胞中,大分子的物质主要通过囊泡运输,Rab蛋白作为囊泡分子运输开关,在囊泡的形成、运输、融合等过程中发挥着重要作用,本文拟通过构建Rab蛋白过表达橙色红曲菌株,来研究Rab蛋白的亚细胞定位以及Rab蛋白之间的相互作用,以寻求Rab家族通过调节囊泡运输、融合等途径在红曲色素合成、桔霉素产生的相关作用,为橙色红曲菌的安全广泛应用奠定基础。主要研究内容如下:1.橙色红曲菌AS3.4384与橙色红曲菌UM28的自体荧光对比研究为了确定橙色红曲菌AS3.4384与橙色红曲菌UM28的自体荧光产生生时间,确定最适实验菌株,分别挑取菌丝,分别在察氏培养基（CD）、察氏培养基+尿苷（CD+U）30℃恒温培养3 d,利用荧光显微镜进行自体荧光观察,研究结果发现,橙色红曲菌AS3.4384产生自体荧光的时间为转接后36-48 h,而橙色红曲菌UM28产生自体荧光的时间为转接后24-36 h,因此,本实验选用橙色红曲菌AS3.4384进行下面的实验。2.Rab蛋白亚细胞定位研究培养24-34 h之后,Rab1主要集中分布在菌丝的尖端、菌丝的隔膜、以及形成的闭囊壳中;Rab2集中出现在菌丝以及形成的闭囊壳中;Rab6A主要集中分布在菌丝的尖端、结点以及形成的闭囊壳;Rab17主要分布在菌丝的尖端,以及刚发芽及即将发芽的菌丝、闭囊壳中。Rab1、Rab2、Rab6A、Rab17均与膜细胞器荧光染料Synapto Red（?）C2、ER-Tracker（?）Red有着明显的重叠现象,表明Rab1、Rab2、Rab6A、Rab17均定位于内质网以及膜细胞器上,也进一步说明Rab1、Rab2、Rab6A、Rab17普遍参与膜运输等生理功能。3.Rab蛋白橙色红曲菌YES液态发酵产桔霉素研究接种于YES液态培养基中,桔霉素含量整体趋势先升高后下降,在发酵第14 d,AS3.4384与红曲Rab1、Rab2、Rab17过表达菌株,桔霉素含量达到最高水平,分别为89.52μg/m L、58.98μg/m L、97.57μg/m L、72.71μg/m L,与野生型菌株相比,Rab1、Rab17的过表达,桔霉素产量分别降低34.12%、18.78%。在YES发酵16 d,红曲Rab6A桔霉素含量达到最大100.3μg/m L。4.Rab蛋白过表达橙色红曲菌大米固态发酵产色素素研究在大米固态发酵30 d中,色素含量整体趋势先升高后下降,野生型菌株AS3.4384与Rab1、Rab2、Rab6A、Rab17过表达菌株,红曲黄色素最大值分别为785 U/g、746 U/g、1148 U/g、887 U/g,与野生型菌株相比,Rab6A、Rab17过表达菌株红曲黄色素含量分别提高1.46倍、1.13倍。在红曲橙色素的测定中,野生型菌株AS3.4384与Rab1、Rab2、Rab6A、Rab17过表达菌株最大含量分别为616 U/g、689 U/g、584 U/g、913 U/g、708 U/g,与野生型菌株相比,Rab1、Rab6A、Rab17过表达菌株红曲黄色素含量分别提高约1.12倍、1.48倍、1.15倍。在红曲红色素的测定中,野生型菌株AS3.4384与Rab1、Rab2、Rab6A、Rab17过表达菌株最大含量分别为743 U/g、752 U/g、700 U/g、1023 U/g、752 U/g,与野生型菌株相比,Rab6A过表达菌株红曲红色素含量提高约为1.38倍。红曲色素总含量的测定中,AS3.4384、Rab1、Rab2、Rab6A、Rab17的红曲总色素含量的最大值分别为2132 U/g、2291 U/g、2030 U/g、3084 U/g、2420 U/g,其中Rab6A、Rab17过表达菌株的总色素含量比野生型菌株AS3.4384分别提高了1.45倍、1.14倍。5.荧光定量PCR研究Rab蛋白在橙色红曲菌中的功能通过Real-time PCR检测Rab1、Rab2、Rab6A、Rab17蛋白的功能。根据测定结果,Rab1、Rab2、Rab6A、Rab17过表达菌株中,其对应的Rab1、Rab2、Rab6A、Rab17基因的表达含量与野生型菌株相比,明显急剧升高,也进一步说明过表达菌株构建成功。在YES发酵第384 h,Rab1、Rab2、Rab6A、Rab17基因的过表达可以显著提高桔霉素合成转录激活因子ctn A的转录水平,但是ctn R的转录水平显著下降,桔霉素合成相关基因PKSCT相对表达量也显著下降,说明在YES发酵第384 h后,Rab1、Rab2、Rab6A、Rab17过表达会抑制桔霉素的整体表达水平。在YES发酵第288 h、384 h,Rab1的过表达显著抑制Rab17的转录水平,说明Rab1与Rab17可能存在相互作用。在YES发酵第288 h,与野生型相比,Rab6A过表达显著抑制Rab17的转录水平,而Rab17过表达又可以显著抑制Rab6A的转录水平,但是在YES发酵第384 h,Rab6A过表达可以显著提高Rab17的转录水平,而Rab17过表达又可以显著提高Rab6A的转录水平,说明Rab6A和Rab17可能存在相互作用。