急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是一种常见的临床疾病，当前中国人口老龄化、具有肾毒性药物使用以及各种医学影像学检查的开展使其发病率不断上升。过度训练致急性肾损伤（overtraining-induced acute kidney injury，OTIAKI）是AKI的一种，近年受到人们的关注。OTIAKI是指剧烈的运动或者体能训练，短时间内导致的非创伤性血尿、蛋白尿或者肾功能的异常，其发病率可占因为训练而导致的住院患者中的82.9％[1、2]。OTIAKI的临床表现可为单纯性尿检异常、尿检异常伴横纹肌溶解症或者并发 ARF，严重的可引起多器官功能障碍进而导致死亡。所以，了解OTIAKI的发病机制及肾脏病理变化，对其进行有效的治疗，对于OTIAKI病人的肾功能恢复及降低病死率有积极的意义。　　促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是1906年由Carnot和Deflandre发现的，至今已有一个多世纪。天然 EPO是一种酸性糖蛋白，相对分子质量为34KD，其分泌的主要细胞为肝脏细胞和肾脏皮质区近曲小管周围的间质细胞[3、4]。人类编码EPO的基因定位于第7号染色体的长臂22区，含有165个氨基酸[5]。重组的人促红细胞生成素（recombinant human erythropoietin，rhEPO）于1989年由Amgen公司研制成功，其相对分子质量约为30KD，与天然的EPO具有相同的理化性质和生物学活性。无论是 EPO还是 rhEPO都必须与其特异性受体（erythropoietin receptor,EPOR）结合，才能发挥有效的生物学效应。EPOR是存在于靶细胞表面上的一种跨膜糖蛋白，相对分子质量为62KD。人类编码EPOR的基因定位于第19号染色体短臂24区，含有507个氨基酸。EPOR包括两个类型：同型二聚体和异源二聚体。EPO与同型二聚体的 EPOR结合后，促进红系祖细胞的增值与分化，发挥促进造血的作用，临床上主要用于纠正各种贫血。EPO与异源二聚体的EPOR结合后，发挥非促进造血作用[6、7]，如细胞保护作用和免疫调节作用等。　　EPO对器官的保护作用，综合目前文献，发现多数集中在对脑部缺血缺氧、神经以及心脏的保护上，对肾脏的器官保护作用研究较少，其中多数集中在肾毒性AKI和缺血再灌注性AKI的模型中，几乎没有关于EPO对OTIAKI的研究，因此，探讨EPO对过度运动致急性肾损伤的保护作用具有良好的临床意义，可以促进运动医学和临床医学的发展。本课题采用大鼠无负重单次游泳力竭致AKI动物模型[8]，分别在力竭后不同时间点下腔静脉采血和取肾脏，采用免疫组织化学染色和病理图像分析软件的方法观察肾脏损伤及Bax、Bcl-2的表达情况，为进一步探明EPO对过度训练致AKI的保护作用提供参考依据。　　研究目的：　　通过免疫组化染色及病理图像分析软件观察各组肾组织Bax和Bcl-2表达情况，结合血清肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）和磷酸肌酸激酶（CK）的变化，以及EPO对其上述变化的干预影响，探讨EPO对过度训练致急性肾损伤的保护作用。　　材料及方法：　　主要材料：6-8周龄雄性SPF级wistar大鼠40只，约200-250g，南方医科大学实验动物中心提供；Anti-Bax antibody（兔抗鼠多克隆抗体），博士德公司提供；Anti-Bcl-2 antibody（兔抗鼠多克隆抗体），博士德公司提供；山羊抗兔二抗，中衫金桥公司提供。　　1.方法　　1）分组：实验大鼠随机分成3组：安静对照组（control，CN组，n=5）、力竭运动组（exhaustive swimming，ES组，n=20）、促红细胞生成素干预组（erythropoietin，EPO组，n=15）。ES组按大鼠力竭后即刻、6h、12h和24h又分为ESI、ES6h、ES12h和ES24h4个亚组（n=5）；EPO组又分为EPO+ES6h、EPO+ES12h和EPO+ES24h3个亚组（n=5）。　　2）动物模型建立：采用大鼠无负重单次游泳至力竭法建立过度训练致急性肾损伤动物模型。大鼠购买后，SPF级动物实验室中安静饲养7天预适应。参照文献[8]方法，自制玻璃钢游泳池（150×60×80cm3），水深约70cm，超过大鼠身长的2倍，水温保持在30±2℃。各实验组大鼠于实验前一天上下午各适应性游泳30分钟，剔除不会游泳的大鼠，实验当天再次放于水中，游泳直至力竭。CN组和ES组分别于游泳前30分钟腹腔内注射生理盐水（0.3ml/kg）作为空白对照。EPO组则注射益比奥（3000 IU/kg）。力竭标准[8]：（1）游泳动作明显不协调；（2）沉入水底超过10s；（3）捞出后没有逃避反应，且放在平面无法完成翻正反射。其中（1）为必须条件。　　3）数据收集:CN组、ES组和EPO干预组分别于相应的时间点腹腔注射10%水合氯醛（0.3ml/kg）麻醉，腹部消毒后沿腹正中线切开，下腔静脉取血后处死，留取左肾组织做石蜡切片。全血3000转/分高速离心10分钟后留取血清，保存于-20℃冰箱，留测血清肌酐、尿素氮、磷酸肌酸激酶。左肾组织置于10%中性福尔马林溶液中固定，石蜡包埋以做常规HE染色观察肾组织病理变化，免疫组织化学染色观察Bax和Bcl-2的表达及分布。采用Olympus BX41光学显微镜观察，Olympus BX40F4显微数码照相机采图，每张切片取5个高倍镜视野，每个视野>500个细胞，分别计算平均光密度值（Average optical density，AOD），平均光密度值=积分光密度值/所选定对象的面积，取平均值，比较各组大鼠肾组织Bax和Bcl-2的表达差异。　　4）统计方法：用SPSS13.0统计分析软件分析，所有数值用均数±标准差（X±S）表示，多组间均数比较采用完全随机设计的方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。　　结果：　　1、CN组大鼠精神状态好，反应敏锐，自由活动，正常饮食饮水。ES组大鼠运动后头部不能抬起，四肢瘫软无力，无法站立，精神差，对声光等刺激反应迟钝，约四十多分钟后才可站立并行走，开始饮水、少量进食。EPO干预组大鼠运动后一般情况处于CN组与ES组之间。　　2、ES组大鼠力竭运动后即刻血清Cr、BUN及CK值均增高，ES6h后达高峰，之后数值逐渐下降，至ES24h约降到正常水平。EPO干预各组的血清Cr、BUN及CK值均较同期ES组改善。　　3、光镜：CN组肾组织无明显改变；ES组及EPO干预组发生急性肾损伤，有肾小球缺血及肾小管缺血缺氧的表现，可见肾小球体积缩小、肾小球囊扩张、毛细血管袢被挤压至血管极测；近端肾小管上皮细胞部分水肿，可有空泡样变性；肾间质水肿、间质内有红细胞及炎症细胞浸润，肾小管损伤积分升高。随着力竭后时间的延长，上述表现更加多且更加严重，并可见到肾小管上皮细胞刷状缘脱落、皮髓质交界处及髓质区大量细胞的细胞核深染，有固缩现象、部分肾小管腔内还可见透明管型、蛋白管型及颗粒管型等，肾小管损伤积分呈上升趋势。EPO干预组与同期力竭运动组相比，肾小球及肾小管损伤程度均变轻，肾小管损伤评分变小。　　4、大鼠无负重单次游泳至力竭后，肾组织Bax免疫组化染色示：CN组Bax弱表达，ES组肾组织细胞胞浆中Bax蛋白的表达随时间的延长逐渐增强，EPO干预各组Bax的表达与CN组相比较，表达增强，与同期力竭组相比较，表达减弱。　　5、肾组织Bcl-2免疫组化染色结果示：CN组有一定的Bcl-2表达，力竭运动后，ES组Bcl-2蛋白的表达呈先减弱后增强的趋势，EPO干预组与同期力竭组相比较，Bcl-2蛋白表达均增强。　　结论：　　1、无负重单次游泳至力竭法成功制作了过度训练致急性肾损伤的动物模型。　　2、EPO预处理可以改善肾功能，减轻肾脏病理损伤，对过度训练致急性肾损伤大鼠起保护作用。　　3、EPO对大鼠的保护作用，可能是通过下调Bax蛋白，上调Bcl-2蛋白表达实现的。