马哈鱼铁蛋白的制备及热处理对其结构的影响

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铁蛋白是一种广泛存在于生命体中的铁贮藏蛋白,对机体铁代谢平衡起着关键作用。目前,国内外许多铁蛋白研究机构已陆续报道了有关高等动物铁蛋白的理化特性和亚基克隆表达等研究工作,但在水产研究领域中,有关铁蛋白的结构与功能研究方面的报道并不多。本研究以银大马哈鱼为原料,通过SDS-PAGE分析铁蛋白的组织分布,铁蛋白在心、肝等内脏组织中高效表达与分布。利用盐析法和柱层析耦合膜分离的方法从马哈鱼内脏中分离提纯获得铁蛋白。通过Native-PAGE和SDS-PAGE对马哈鱼铁蛋白的分子量进行了分析,并通过透射电子显微镜观察到铁蛋白分子形态,其蛋白质中心含有8 nm的铁核。利用CE-MS对纯化得到的铁蛋白亚基氨基酸序列进行鉴定,分析结果与NCBI中银大马哈鱼(Oncorhynchus kisutch)基因库进行比对,鉴定得到了分子量为20.71 k Da的ferritin heavy subunit,将其氨基酸序列与人的HF亚基序列进行对比,序列相似性极高,且含有相同的活性中心位点。根据质谱分析比对得到的ferritin heavy subunit亚基基因序列设计引物,进行铁蛋白的原核表达。通过构建重组表达质粒p ET21a-fer H,在大肠杆菌BL21中对铁蛋白诱导表达,诱导剂选择浓度为0.8 mmol/L的IPTG,诱导温度为37℃,诱导时间为8 h,此时铁蛋白表达量达到最大。表达后的铁蛋白存在于细胞内,利用超声细胞破碎仪将细胞破碎,经SDS-PAGE分析,表达产物以不可溶的包涵体以及可溶性蛋白两种形式存在。选择可溶性蛋白部分进行进一步的纯化,通过DEAE弱阴离子交换层析纯化得到铁蛋白。对纯化得到的铁蛋白进行结晶并利用X射线晶体衍射研究其晶体结构。根据分析结果绘制出铁蛋白亚基结构图,每个亚基含有一个铁离子作为配体。铁蛋白为4-3-2重轴对称的结构,亚基聚集后会形成一个笼形结构。23位的Glu、58位的Glu与61位的His组成一个活性中心,与铁离子相互作用。通过差示扫描量热法确定重组马哈鱼铁蛋白的变性温度为76℃。根据该变性温度选择65℃、75℃、85℃、95℃、100℃五个温度分别对马哈鱼铁蛋白进行20 min热处理。利用SDS-PAGE以及Native-PAGE初步分析不同温度处理后铁蛋白的结构变化,亚基分子量无变化,说明热处理对铁蛋白一级结构无影响。而Native-PAGE显示铁蛋白在高于75℃处理后结构逐渐发生变化,至100℃时则完全变性。通过圆二色谱分析,随着热处理温度的提升,铁蛋白的α-螺旋与β-转角含量下降,β-折叠与无规则卷曲含量升高;粒径分析显示铁蛋白逐渐变性发生了热聚集。随着热处理温度的提升,荧光光谱在340 nm处样品的荧光强度随着热处理温度的升高而不断减小。100℃加热处理20 min后,荧光峰发生了红移现象,说明铁蛋白已经完全变性。
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