研究背景:乳腺癌(Breast cancer,BC)是全世界女性最常见的恶性肿瘤,其死亡率位居女性恶性肿瘤的首位。目前已明确侵袭和转移是乳腺癌的主要生物学特征,是一个多步骤、多因素共同参与的连续过程,也是导致乳腺癌患者死亡的主要原因。随着乳腺癌分子生物学研究的进展,针对不同分期、细胞受体、分子分型等的靶向治疗成为临床研究热点,推动了乳腺癌治疗实现“个体化”的进程。自1998年首次批准分子靶向药物曲妥珠单抗应用于实体肿瘤治疗以来,涌现了越来越多的分子靶向治疗药物,如CDK4/6抑制剂呢泊塞克雷(Palbociclib)、雌激素拮抗剂他莫昔芬(Tamoxifen)、mTOR靶蛋白的抑制剂依维莫司(Everolimus)等。这些药物的临床应用虽然显著提高了乳腺癌的治疗效果,但针对转移性乳腺癌患者的预后依旧欠佳。因此,深入研究乳腺癌侵袭和转移的分子机制并寻找有效的治疗靶点,对于研发新型分子靶向药物、改善转移性乳腺癌患者的预后和生存质量具有重要意义。微小RNA(miRNAs)是一种内源性的非编码小分子RNA,长度约为18-25个核苷酸。miRNA可通过与特定mRNA的3’-UTR(3’-非翻译区)部分序列相结合,介导其转录、翻译过程,在蛋白质表达的调节中起着关键作用。由于基因突变是肿瘤发生的一个常见原因,能够影响肿瘤的演进。因此人们普遍认为,miRNA的异常表达与肿瘤细胞的增殖、转移、凋亡等生物学行为密切相关。T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam1)于1994年首次发现,是Rac1、RhoA、Cdc42等Rho样GTPase的鸟核苷酸交换因子,属小鼠T淋巴瘤侵袭表型基因。研究显示,虽然人类的Tiam1基因定位于21号染色体q22.1、小鼠的Tiam1基因定位于16号染色体,但是人类和小鼠的Tiam1基因产物却具有95%的同源性。在人体中,Tiaml主要参与调控细胞增殖、分化、粘附、迁移和浸润等生物学过程。Huang等研究发现,Tiaml蛋白在发生转移的肝癌组织中表达水平显著高于未发生转移的肝癌组织,且Tiaml高表达提示患者预后不良。Liu等报道显示,沉默Tiaml可以抑制食管鳞癌细胞的增殖、迁移和浸润,诱导细胞凋亡及细胞周期阻滞。本课题组的前期研究发现,Tiam1在乳腺癌组织中高表达,且Tiam1高表达患者的生存期显著短于Tiaml低表达患者,但其调控乳腺癌演进的具体作用机制尚不明确。因此,揭示Tiam1在乳腺癌演进过程中的作用机理及临床意义,将为乳腺癌患者的临床生物学治疗提供潜在的有效靶点。研究目的:旨在阐明miR-21-5p/Tiam1对乳腺癌生物学行为的影响,并探究其相关的分子机制。(1)评估Tiam1蛋白过表达在乳腺癌患者早期诊断及预后中的临床价值。(2)分析Tiaml蛋白对乳腺癌细胞生长、转移和Warburg效应的影响,并探究其可能的调控机制。(3)明确参与调控Tiaml的miRNA,进一步揭示miR-21-5p/Tiam1调控乳腺癌演进的作用机制。材料与方法:(1)组织标本及数据库分析:采用免疫组织化学法检测157例乳腺癌组织和37例正常乳腺组织中Tiaml蛋白的表达情况,并分析其过表达与乳腺癌临床病理学特征之间的关系。通过Kaplan Meier-plotter数据库分析Tiam1蛋白过表达在乳腺癌患者预后评估中的价值。(2)体外实验:通过慢病毒转染及嘌呤霉素筛选构建Tiam1沉默及Tiam1过表达的乳腺癌细胞株。利用噻唑蓝实验(MTT)、平板克隆形成实验和EdU增殖实验检测Tiam1蛋白对乳腺癌细胞增殖能力的影响。采用划痕、迁移和浸润实验检测TiamI蛋白对乳腺癌细胞转移能力的影响。通过对比人脐静脉内皮细胞(HUVECs)成管能力分析Tiam1蛋白对乳腺癌血管生成能力的影响。利用代谢试剂盒检测Tiam1蛋白对乳腺癌细胞葡萄糖摄取、乳酸生成及ATP水平的影响。通过免疫蛋白印迹和免疫荧光实验检测Tiam1蛋白对EMT标志物和糖酵解相关标志蛋白表达水平的影响。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和双荧光素酶报告基因实验明确miR-21-5p和Tiam1之间的靶向关系。(3)体内实验:在裸鼠双侧皮下接种Tiam1蛋白沉默及过表达的乳腺癌细胞,比较Tiam1差异表达对裸鼠皮下荷瘤的影响。通过裸鼠尾静脉注射建立裸鼠转移瘤模型,对比Tiam1蛋白差异表达时裸鼠肺部转移灶的形成情况,并通过苏木素-伊红染色进一步确认。对裸鼠瘤体切片进行免疫组织化学染色,对比Tiam1差异表达对Ki67及EMT相关蛋白表达水平的影响。结果:(1)Tiam1蛋白在乳腺癌组织中的表达水平显著升高,且提示患者预后不良:Tiam1在乳腺癌组织中的阳性表达率及强阳性表达率分别为77.7%和65.6%,显著高于正常乳腺组织(29.7%,10.8%),且其表达水平与乳腺癌患者的临床分期、分化程度、淋巴结转移及Her2水平密切相关。Kaplan-Meier plotter数据库统计分析显示,在乳腺癌患者中,Tiam1过表达患者的生存期显著缩短。(2)Tiam1过表达促进乳腺癌的增殖:MTT、平板克隆形成和EdU增殖实验显示,Tiam1过表达可促进乳腺癌细胞的体外增殖能力。裸鼠荷瘤实验显示Tiam1过表达能够促进乳腺癌细胞的皮下荷瘤能力。(3)Tiam1通过诱导EMT进程促进乳腺癌的转移:划痕、迁移和浸润实验显示,Tiam1过表达可促进乳腺癌细胞的迁移和浸润能力。体内实验进一步证实了 Tiam1过表达促进乳腺癌细胞的体内转移能力。此外,免疫蛋白印迹和免疫荧光实验结果显示Tiam1沉默显著上调E-cadherin表达,下调间质标志物Vimentin等的表达,而Tiam1过表达时则结果相反。(4)Tiam1过表达促进乳腺癌的血管形成能力:体外血管生成实验显示,Tiam1沉默可显著抑制HUVECs的成管能力,而Tiam1过表达后,HUVECs的成管能力则显著提高。免疫蛋白印迹实验结果显示Tiam1沉默可下调MMP2和VEGF蛋白的表达,而Tiam1过表达则上调相关蛋白的表达水平。(5)Tiam1通过Warburg效应促进乳腺癌的增殖和转移:代谢试剂盒检测结果显示,Tiam1沉默可降低葡萄糖摄取、乳酸生成及ATP的水平。Tiam1过表达则增加葡萄糖摄取、乳酸生成及ATP的水平。与代谢试剂盒检测结果一致,沉默Tiam1能够抑制GLUT4、HK2等糖酵解相关蛋白的表达。相反,过表达Tiam1则增加糖酵解相关蛋白的表达水平。此外,予以糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)和3-溴丙酮酸(3-BrPA)可明显抑制Tiam1蛋白过表达所诱导的促进肿瘤增殖及转移的能力。(6)miR-21-5p靶向调控Tiam1的表达:四种靶基因预测软件筛选出潜在调控Tiaml的靶基因miR-21-5p。进一步的双荧光素酶报告基因检测结果显示,miR-21-5p通过直接结合Tiaml的3’-UTR(3’-非翻译区)从而抑制Tiaml的表达。(7)miR-21-5p/Tiaml调控乳腺癌的Warburg效应和转移:乳腺癌细胞共转染miR-21-5p抑制因子和si-Tiam1,结果显示Tiam1沉默能够显著减弱miR-21-5p抑制因子对乳腺癌糖酵解和转移的调控能力。结论:(1)Tiam1蛋白在乳腺癌组织中的过表达与乳腺癌患者的临床分期、分化程度、淋巴结转移及Her2水平密切相关,且预示乳腺癌患者的不良预后。(2)Tiam1过表达可促进乳腺癌细胞的增殖,并通过EMT途径调控乳腺癌细胞的转移。(3)Tiam1蛋白促进乳腺癌细胞的Warburg效应,并通过Warburg效应调控乳腺癌的增殖和转移。(4)miR-21-5p/Tiam1在乳腺癌的演进过程中扮演着重要的角色,且通过Warburg效应调控乳腺癌的增殖和转移。