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背景:变异链球菌(Streptococcus mutans)是引起人类龋病的主要致病菌之一。它的高致龋能力与其产酸、耐酸、生物膜形成能力等特性密切相关。作为兼性厌氧革兰氏阳性菌,其脂磷壁酸(Lipoteichoic acid,LTA)是胞壁的重要组成成分,也是主要的致病成分之一。现有的研究表明,脂磷壁酸骨架上的D-丙氨酸酯结构对细菌的生理代谢活动具有调控作用。D-丙氨酸酯结构是脂磷壁酸经过D-丙氨酰化修饰的产物,该过程所需的相关酶由dlt操纵子编码。脂磷壁酸D-丙氨酰化对变异链球菌生物膜形成、耐酸等生理功能具有一定影响,然而其具体机制及调控途径尚未明确。目的:1)本文通过构建变异链球菌脂磷壁酸D-丙氨酰化缺陷株,探究脂磷壁酸D-丙氨酰化过程对于变异链球菌生物膜形成能力、产酸耐酸能力、菌种间竞争力的影响;2)探究细菌双组分信号转导系统对脂磷壁酸D-丙氨酰化过程的调控作用。材料与方法:1)利用同源重组原理构建变异链球菌dlt C缺失株,命名为SMUA159-△dlt C。通过2,4-二硝基苯肼实验检测SMUA159-△dlt C脂磷壁酸D-丙氨酸含量、全自动生长曲线分析仪绘制生长曲线、革兰氏染色观察细菌形态;2)分光光度计检测SMUA159、SMUA159-△dlt C自聚能力、倾斜培养检测细菌黏附能力;细胞色素C检测浮游态及生物膜状态下SMUA159、SMUA159-△dlt C表面电荷量;分别构建SMUA159、SMUA159-△dlt C早期(6h)及成熟(24 h)生物膜,采用蒽酮法检测生物膜水溶性及非水溶性胞外多糖含量,荧光染色观察胞外多糖分布及生物膜形成过程,Real-time PCR检测生物膜形成相关基因表达。3)检测不同p H培养基中SMUA159-△dlt C产酸能力、菌落计数(Colony-Forming Units,CFU)比较SMUA159、SMUA159-△dlt C浮游状态及生物膜状态下固有耐酸及诱导性耐酸响应(acid tolerance response,ATR)能力。4)琼脂平板及条件性培养基实验比较SMUA159、SMUA159-△dlt C代谢产物对口腔共生菌血链球菌(Streptococcus sanguinis,S.sanguinis)、戈登链球菌(Streptococcus gordonii,S.gordonii)的抑制作用;采用悬吊法在牛牙釉质块上构建双菌种生物膜(SMUA159+S.sanguinis、SMUA159+S.gordonii、SMUA159-△dlt C+S.sanguinis、SMUA159-△dlt C+S.gordonii),通过检测培养基p H、钙离子浓度比较生物膜的脱矿作用、CFU比较双菌种生物膜中各细菌所占比例;Real-time PCR检测变链素形成、产酸相关基因表达。5)构建变异链球菌双组份信号转导系统Lia SR表达缺陷株:利用同源重组原理构建变异链球菌lia S、lia R基因缺失株,命名为SMUA159-△lia S、SMUA159-△lia R;Real-time PCR检测酸性环境以及生物膜状态下SMUA159-△lia S、SMUA159-△lia R中dlt C基因表达水平。结果:1)dlt C基因缺失株扩增片段测序结果显示目的基因dlt C已被抗性基因所取代,变异链球菌dlt C缺失株(SMUA159-△dlt C)构建成功。dlt C基因缺失后,变异链球菌脂磷壁酸中D-丙氨酸含量显著下降(p<0.05),细菌生长并未受显著影响,细菌链长增加。2)dlt C基因敲除后,变异链球菌无法形成致密的生物膜,其中存在大小不一的空隙,且缺乏三维立体结构,呈“平坦状”。相较于原始株,SMUA159-△dlt C自聚能力显著增强(p<0.05);黏附能力下降(p<0.05);浮游态及生物膜状态下,细菌表面负电荷均显著增加(p0.05),gtf C、gbp A相对高表达,而gtf B表达水平仍低于原始株(p<0.05)。3)SMUA159-△dlt C在酸性培养基中产酸能力较原始株弱;浮游态SMUA159-△dlt C耐酸能力显著下降,但ATR仍然存在;生物膜状态下SMUA159-△dlt C固有耐酸能力及ATR与原始株相比均无明显变化。4)dlt C基因敲除后,变异链球菌所产生的代谢产物对S.sanguinis、S.gordonii抑制作用显著减弱;双菌种生物膜中,变异链球菌所占比例显著下降,对釉质块表面脱矿作用显著减弱;变链素合成及产酸相关基因表达水平下降。5)变异链球菌lia S、lia R缺失株(SMUA159-△lia S、SMUA159-△lia R)构建成功。SMUA159-△lia S在酸性环境或生物膜状态下,dlt C基因表达较原始株上调(p0.05),生物膜状态下其表达较原始株上调(p<0.05)。结论:脂磷壁酸D-丙氨酰化对变异链球菌致龋力的表达具有重要影响。1)脂磷壁酸D-丙氨酰化过程可影响变异链球菌的自聚、黏附、表面电荷量以及胞外多糖的合成从而改变其生物膜特点;2)脂磷壁酸D-丙氨酰化过程可改变变异链球菌浮游状态下的产酸总量及耐酸能力;对位于生物膜中的变异链球菌耐酸能力无显著影响。3)脂磷壁酸D-丙氨酰化过程可调控变链素合成及产酸导致变异链球菌的菌种间竞争力下降。4)在酸性环境及生物膜状态下,Lia SR双组份信号转导系统对脂磷壁酸D-丙氨酰化过程存在负调控作用。该研究为进一步阐明变异链球菌的致龋机制提供了理论依据。