片形吸虫病（Fasciolosis）是由大片吸虫（Fasciola gigantica）和肝片吸虫（Fasciola hepatica）引起的一种人畜共患寄生虫病。该病主要感染反刍动物和人,是一种食源性寄生虫病,受到感染的动物或人表现为急性肝炎、慢性肝纤维化、胆管炎等,严重时能造成动物的大量死亡,对人类及畜牧业的危害十分严重。目前对于该病的防控主要依赖于药物治疗,因此,对于该病的诊断、尤其是早期诊断尤为重要,能够做到早诊断、早治疗,就能减少该病对人类及动物健康的危害,降低畜牧业的经济损失。片形吸虫病的诊断研究一直是该领域的研究热点。目前临床上主要采用的经典粪便虫卵镜检法不能应用于片形吸虫病的早期诊断;国际上虽然存在几种较好的免疫学诊断方法,但是其诊断抗原多为虫体纯化的天然混合抗原,成本高,具有一定交叉反应。为解决这一重要难题,本课题在前期的蛋白组学的基础上,通过生物信息学方法筛选到一些候选的诊断靶标,通过原核表达、蛋白纯化、Western bloting对诊断靶标进行筛选及评价,并筛选到一个新组织蛋白酶（命名为CL7）,建立了间接ELISA方法,并用该方法对田间样品进行了检测。随后对筛选的诊断靶标蛋白CL7进行单克隆抗体及多克隆抗体制备,进而建立了双抗夹心ELISA方法,用于检测片形吸虫的循环抗原,以达到片形吸虫病的早期诊断的目的。具体内容概述如下:1.诊断靶标的筛选、表达纯化及间接ELISA方法的建立和优化本研究选取 Annexin（Ann）、Leucine aminopeptidase（LAP）、CUB domain protein（CUB）以及一个命名为CathepsinL7（CL7）新的组织蛋白酶家族成员的蛋白基因进行分子克隆、载体构建、体外原核表达,蛋白纯化,用Western bloting对四个诊断靶标进行筛选及评价,随后以四种蛋白为包被抗原建立相应的间接ELISA（indirect enzyme linked immunoabsordent assay iELISA）方法以筛选最佳诊断靶标。使用片形吸虫感染的羊阳性血清和健康羊阴性血清用来评价其敏感性,结果表明:Ann、CUB敏感性（SEN）较低;LAP、Ann+LAP、CL7的敏感性较高。使用片形吸虫感染的羊阳性血清（n=16）和其他常见寄生虫阳性血清（n=16）,进行交叉反应,结果显示CL7特异性（SPE）最高,其他二者次之。在四个靶标蛋白中CL7是最有潜力的。2.CL7生物信息学分析、单克隆抗体的制备及夹心ELISA方法的建立本实验首次对CL7基因进行研究,通过生物信息学分析,证明其属于CL家族一员（组织蛋白酶L）,因此命名为（CL7）,并将其基因序列上传GenB ank,基因号:MN150457。同时本文对CL7还进行结构域分析、建模和可靠性3D建模。为建立适用于早期诊断的夹心ELISA（sandwich ELISA sELISA）方法,以CL7作为免疫原分别免疫小鼠和新西兰兔,成功获得11株CL7单克隆抗体（mAbs）和兔多克隆抗体。选取四株高滴度单抗:2B5、3B10、5A2、9H9进行小鼠腹水的制备、纯化、效价测定,亚型表位鉴定。结果表明:2B5、3B10、5A2、9H9分别属:IgG1、IgG2b、IgG1、IgG3,叠加ELISA结果显示2B5与5A2识别相似或相同表位,3B10与9H9识别相似或相同表位。用2B5和3B10与兔多克隆抗体进行组合,建立多种sELISA方法。对比发现CL7单抗2B5与兔多抗组合建立的sELISA效果最佳。并对该CL7 sELISA建立标准曲线,用于循环抗原CL7的定量分析。经ROC统计分析显示:CL7 sELISA对片形吸虫感染羊血清（n=12）检测下线为1.087ng/mL（Cut-off:0.4115）,并将上述阳性血清用于SEN与SPE的评估,结果表明二者均达到100%,CL7 sELISA检测不同感染期水牛的阳性（3-7感染周）、阴性血清时,检测下线为2.009 ng/mL（Cut-off:0.4845）,SPE达到100%,SEN达到93.75%。因此CL7 sELISA可应用于反刍动物片形吸虫的早期诊断。综上所述,本实验成功表达了四种片形吸虫重组蛋白,发现了一个良好的诊断靶标蛋白CL7,并建立了一种可以用于早期诊断的sELISA方法,对片形吸虫的诊断具有重要的应用价值。