【摘 要】
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禽呼肠孤病毒（avian reovirus,ARV）在鸡群中普遍存在,与病毒性关节炎/腱鞘炎、矮小综合征、慢性呼吸道疾病相关,并能导致免疫抑制,给养禽业造成严重的经济损失。p17是ARV编码的一种非结构蛋白,可诱导细胞自噬进而促进病毒增殖,与病毒的致病作用关系密切。本研究拟筛选与p17互作的宿主蛋白,探讨其与病毒复制的关系,为深入阐明ARV感染的致病机制奠定基础。1.与ARV p17互作的宿主蛋白
【基金项目】
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国家自然科学基金青年基金项目（编号:31902250）； 国家现代农业产业技术体系（CARS-40-K16）； 江苏高校优势学科建设工程项目；
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禽呼肠孤病毒（avian reovirus,ARV）在鸡群中普遍存在,与病毒性关节炎/腱鞘炎、矮小综合征、慢性呼吸道疾病相关,并能导致免疫抑制,给养禽业造成严重的经济损失。p17是ARV编码的一种非结构蛋白,可诱导细胞自噬进而促进病毒增殖,与病毒的致病作用关系密切。本研究拟筛选与p17互作的宿主蛋白,探讨其与病毒复制的关系,为深入阐明ARV感染的致病机制奠定基础。1.与ARV p17互作的宿主蛋白筛选以ARV GX/2010/1株感染7日龄SPF鸡,每只鸡的感染量为104.3TCID50。7天后提取鸡肝组织总RNA,应用SmartTM技术构建ARV感染鸡肝组织cDNA文库,文库滴度为2.6×107cfu/mL。构建表达p17的重组诱饵质粒pGBKT7-p17,将其转化至酵母感受态细胞Y2H Gold中,检测显示该质粒无自激活活性并对酵母菌无毒性。利用酵母双杂交系统筛选,并经酵母回补验证,共得到9个与p17互作的宿主蛋白。经测序并与NCBI数据库比对,9个宿主蛋白分别为核糖磷酸焦磷酸激酶2（PRPS2）、γ-干扰素诱导蛋白16（IFI16）、聚谷氨酰胺结合蛋白1（PQBP1）、核仁GTP结合蛋白1（GTPBP4）、胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1（IGF2BP1）、羧酸酯水解酶（CES1L2）、成纤维细胞生长因子1（FGF1）、3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸合酶（PAPSS2）和钙黏蛋白-2（CDH2）。通过gene ontology（GO）通路注释分析,这9个与p17互作的宿主蛋白参与细胞代谢过程及具有催化活性。其中,PRPS2参与嘌呤代谢和蛋白质的合成,并与抑制细胞增殖、阻滞细胞周期和引发细胞凋亡等密切相关。2.PRPS2与p17互作的鉴定及其对ARV复制的影响本研究进一步验证PRPS2与p17的相互作用并探究PRPS2对病毒复制的影响。分别构建重组质粒pcDNA-Myc-p17和pcDNA-Flag-PRPS2,共转染DF-1细胞,经间接免疫荧光试验,于激光共聚焦显微镜观察发现p17与PRPS2在细胞内具有共定位现象;通过免疫共沉淀检测,PRPS2与p17在细胞内具有相互作用;构建pEGX-6p-1-p17原核表达载体,通过GST pull-down证明p17与PRPS2在细胞外也能够相互结合。ARV感染DF-1细胞,经q-PCR检测在不同时间点PRPS2的mRNA表达水平,发现PRPS2在ARV感染早期表达水平显著上调,推测PRPS2可能参与病毒的增殖过程。将质粒pcDNA-Flag-PRPS2和空白载体pcDNA3.1分别转染DF-1细胞,再感染ARV病毒,分别在感染后不同时间点收集细胞总RNA和蛋白样品。经q-PCR检测发现,过表达PRPS2细胞在ARV感染24 h时病毒复制水平达到峰值,比空载体组感染病毒细胞提高了约30%。同样,我们观察到在过表达PRPS2的情况下,ARV p17蛋白的表达量也显著增加。结果表明,过表达PRPS2能显著促进ARV复制。利用si RNA技术敲低PRPS2表达,q-PCR检测显示si-PRPS-1和si-PRPS-2均能显著下调PRPS2的mRNA转录水平。在DF-1细胞中分别转染si-PRPS2-1、si-PRPS-2和Nc-si RNA,再感染ARV,分别在不同时间点收集细胞总RNA和蛋白样品。经q-PCR检测发现,在ARV感染6 h、12 h和24 h三个时间点,敲低PRPS2表达可使得ARV复制水平显著下降,并且敲低PRPS2可导致p17蛋白水平明显降低。结果表明,敲低PRPS2可显著抑制ARV的复制。综上所述,本研究首次发现并证实宿主PRPS2蛋白与ARV p17非结构蛋白之间存在相互作用,并且PRPS2对ARV的增殖具有正向调控作用。
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