禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli,APEC）是在禽类中广泛传播,可引起禽类严重的局部和/或全身性感染的重要肠道外致病菌,给养禽业造成巨大经济损失。APEC抗原分型复杂多样,一般以O抗原为主要分型依据,常见致病性菌株包括O1、O2、O78等血清型。在肠外环境中摄取铁的能力是APEC生存的前提,为了适应贫铁环境,APEC进化出多种铁摄取系统,以满足对铁的需求,包括:SitABCD铁转运系统,血红素,肠菌素、气杆菌素、沙门菌素和耶尔森菌素等铁载体系统,然而这些铁摄取系统的许多组成部分功能仍不清楚。前期研究对本室分离、鉴定、保存的APEC O1型强毒株E516菌株进行基因组测序,以本室分离、鉴定、保存的E058（02）和E522（O78）菌株基因组序列为参考,发现了只存在于E516菌株而不存在于E058（02）和E522（O78）菌株的两个假定的铁转运基因,由于它们与尿道致病性大肠杆菌CFT073的c2515（768bp）和c2516（1059bp）基因100%同源,因此我们亦将其命名为c2515和c2516。在本研究中,我们构建了 E516 c2515和c2516基因缺失株及回补株,并通过体外和体内试验研究了它们的生物学特性和致病性。本研究通过逆转录PCR（RT-PCR）、生长特性测定、CAS试验、HD11胞内存活试验、致病性试验等方法,分析了c2515、c2516基因功能及各菌株生物学特性。RT-PCR分析表明破坏目标基因阅读框可终止其转录;CAS试验显示E516Δc2515、E516△c2516和E516Δc2515Δc2516产生铁载体的能力较E516相比有所减弱;生长曲线显示各缺失株生长速度在贫铁条件下较野生株缓慢,而在补铁后及普通LB培养基中生长速度基本一致;铁摄取试验显示与野生菌E516相比,各缺失株胞内铁含量降低;细胞感染试验表明,HD11细胞更容易清除铁摄取缺陷型的突变株。上述各试验中双基因缺失株E516Δc2515△c2516与野生株E516相比差异最为显著,E516Δc2515次之,E516Δc2516差异较小。1日龄SPF鸡半数致死量（LD50）及细菌体内定殖试验显示,与野生菌株相比,c2515和c2516基因的缺失影响了 E516菌株在鸡组织中的定殖能力,并且双基因缺失株比野生株毒力下降10倍左右。荧光定量PCR（qRT-PCR）结果表明,在E516Δc2515Δc2516双基因缺失株中,铁摄取相关基因entA,fepC和iutA的转录水平显著低于野生株。总体而言,c2515和c2516可能参与铁载体介导的铁摄取并参与APEC O1菌株E516的致病过程。以上结果提示c2515基因对E516毒力影响更大,为了从蛋白水平研究该基因的功能,我们研制了 C2515蛋白的单克隆抗体（Monoclonalantibody）。通过构建原核表达载体pET11b-c2515-His并导入E.coli BL21（DE3）,诱导表达后,对包涵体形式表达的重组蛋白进行尿素梯度变复性,纯化得到蛋白分子量为28.2 kDa的重组蛋白,与预期一致。C2515蛋白免疫BALB/c小鼠,经过方阵滴定试验,确定间接ELISA（Enzyme linked immunosorbent assay）的最佳适包被抗原浓度为:1.5 μg/mL,选择血清抗体效价最高的小鼠进行细胞融合,经三次亚克隆筛选出3株能稳定分泌C2515特异性抗体的杂交瘤细胞株:1C4、3D6、4B9,经抗体亚类试剂盒鉴定,1C4属于IgG2b亚类,3D6、4B9属于IgG1亚类,3株均属于κ轻链。Western blot结果表示,3株单克隆抗体均可与免疫原C2515蛋白特异性结合,并只能在E516菌株中检测出天然C2515蛋白而在E058和E522中未检测出,与PCR检测结果一致。C2515单抗的获得为其后续功能研究提供了可靠材料,也为进一步研究其在铁摄取系统中的作用奠定了基础。