论文部分内容阅读
木质纤维素是世界上最丰富的可再生生物资源,它可以通过生物炼制转化为生物燃料、生物基化学品和生物基材料,是代替石油等资源最佳选择。木质纤维素生物炼制中的生物转化法具有环境友好、能耗低及反应条件温和等特点,受到了广泛的关注。木质纤维素生物转化法的瓶颈之一是纤维素酶的成本过高,如何降低纤维素酶的成本是当前的研究热点之一。商品化的纤维素酶主要产自里氏木霉等真菌。东方肉座菌EU7-22是本实验室分离和诱变的木霉属真菌,它分泌的纤维素酶系和半纤维素酶系组份齐全,生长速度快,是潜在的可工业化生产纤维素酶的菌株。本实验室已经克隆了东方肉座菌的主要纤维素酶、半纤维素酶和一些转录调控因子的基因,并研究了碳代谢阻遏因子Cre1和转录因子Ace3对东方肉座菌纤维素酶的转录调控作用。对东方肉座菌EU7-22产纤维素酶的调控因子的进一步研究,不仅在理论上可以阐明其纤维素酶表达调控体系,还有助于推动其工业化应用。本论文研究了调控因子Cre2、Ace1和Xyr1对东方肉座菌EU7-22产纤维素酶的影响,克隆了东方肉座菌EU7-22的木聚糖酶3基因及其侧翼序列,构建了高产β-葡萄糖苷酶的工程菌株和高产纤维素酶的工程菌株。本论文的主要研究结果如下:（1）利用简并PCR、hi TAIL PCR克隆了东方肉座菌EU7-22的cre2基因及其5’和3’侧翼序列,得到的cre2序列为2516 bp,5’侧翼序列4409 bp和3’侧翼序列1300bp,其中cre2包含了 3个内含子。Cre2蛋白有741 aa,与Trichoderma reesei QM6a的Creb蛋白序列同源率为95%。利用同源双交换的方法敲除了东方肉座菌EU7-22的cre2基因,敲除菌株Δcre2-3分别在葡萄糖、木糖、纤维二糖、CMC-Na和微晶纤维素为碳源的培养基上生长时,Δcre2-3和EU7-22的菌落和孢子形态基本一致。在以微晶和麸皮为诱导物培养Δcre2-3过程中,Δcre2-3的纤维素酶活和蛋白分泌量达到峰值的时间相对原始菌提前,其中FPase和PNPGase的最高酶活力高于原始菌株EU7-22。虽然Δcre2-3的半纤维素酶活达到最大值的时间也提前了,但Δcre2-3木聚糖酶和PNPXase酶的活性相对原始菌却明显降低,Δcre2-3的木聚糖酶活和β-木糖苷酶酶活相对原始菌EU7-22分别下降33.53%和81.89%,该结果与已有的文献报道不同,说明cre2对东方肉座菌纤维素酶和半纤维素酶的调控具有菌株特异性。（2）通过hi TAIL PCR克隆得到了东方肉座菌EU7-22的ace1基因的5’侧翼序列939 bp和3’侧翼序列1626 bp,在此基础上构建了东方肉座菌ace1的敲除菌。ace1基因敲除菌Δace1-1在不同碳源平板上生长的表型与原始菌株EU7-22基本一致,但除在葡萄糖为碳源的平板上生长速度比EU7-22略快外,在其它碳源平板上的生长速度比原始菌都慢。在微晶和麸皮诱导下,Δace1-1菌株的主要纤维素酶和半纤维素酶达到最高酶活的时间相对原始菌都提前,而且该菌株的FPase酶活、CMCase酶活和木聚糖酶酶活的最高活性相对原始菌的最高酶活都有所提高,它们分别是原始菌的114%、103%和118%。通过构建G418筛选标记的cre2敲除盒,在菌株Δace1-1中敲除了 cre2基因,构建了 ace1和cre2双基因敲除菌Δace1 cre2-5,研究两者对东方肉座菌产纤维素酶的协同作用。Δace1cre2-5菌株在葡萄糖平板上生长比原始菌快,但是当以纤维素或半纤维素作为碳源时,其生长速度明显比原始菌要慢。Δace1cre2-5菌株在诱导培养过程中虽然主要纤维素酶和半纤维素酶相对原始菌更快达到峰值,但是所有的酶活相对原始菌株都降低了。Δace1cre2-5的FPase酶活,CMCase酶活、PNPCase酶活、PNPGase酶活、木聚糖酶酶活和PNPXase酶活性相对原始菌EU7-22分别降低了14%、16%、32%、30%、10%和49%,说明这个两个负调控因子同时缺失不利于东方肉座菌纤维素酶和半纤维素酶的表达。（3）通过hi TAIL PCR克隆得到东肉座菌EU7-22的xyr1基因5’侧翼序列3164 bp,3’侧翼序列1379 bp。在此基础上构建了东方肉座菌EU7-22的xyr1敲除菌Δxyr1-3。该菌株在诱导培养下几乎检测不到任何纤维素酶和半纤维素酶活性,表明转录调控因子Xyr1是东方肉座菌纤维素酶表达和半纤维素酶表达的关键激活因子。以里氏木霉QM9414的丙酮酸脱羧酶的启动子和终止子在东方肉座菌EU7-22中过表达xyr1,获得了 5个转化子,其纤维素酶活相对原始菌都有了显著的提高,其中菌株dxyr-1的纤维素酶活最高。dxyr-1菌株的FPase酶活、CMCase酶活、PNPCase酶活和木聚糖酶酶活分别是原始菌EU7-22的183%、198%、200%和110%。但dxyr1-1的PNPGase酶活没有提高,PNPXase酶活甚至相对原始菌有明显的下降。从总体上看,xyr1的过表达是增加东方肉座菌纤维素酶活性的有效手段。（4）利用简并PCR和染色体步移法克隆了东方肉座菌EU7-22的木聚糖酶3基因xyn3及其侧翼序列。克隆得到的xyn3及其5’和3’侧翼序列的长度分别为1283 bp、3904 bp和1476bp,该基因有3个内含子。木聚糖酶3蛋白XYNⅢ由348 aa组成,根据预测发现该蛋白的N端14个氨基酸为信号肽,成熟蛋白的分子量为36.55kDa,等电点为6.14。根据系统进化树分析,东方肉座菌EU7-22的XYNⅢ属于糖苷水解酶10家族,与拟康氏木霉Trichoderma pseudokoningii的内切木聚糖酶在进化上最接近。以xyn3的启动子和终止子在东方肉座菌EU7-22过表达了 β-葡萄糖苷酶1,得到了两个转化子bgl-1和bgl-2,bgl-1和bgl-2的PNPGase酶活相对原始菌EU7-22分别提高了 150%和300%,FPase酶活相对原始菌分别提高了 17%和35%,该结果表明利用xyn3的启动子可以构建东方肉座菌高产β-葡萄糖苷酶的菌株。（5）在重组菌dxyr-1的基础上以里氏木霉QM6a烯醇酶基因（eno）的启动子和终止子过表达ace3基因,得到了 8个转化子,其中6个菌株纤维素酶活都提高了,其中活性最高的是菌株dxyA-8。重组菌dxyA-8诱导培养4 d后,FPase酶活、CMCase酶活、PNPCase酶活、PNPGase酶活,木聚糖酶酶活和蛋白分泌量分别是原始菌EU7-22的334%、223%、264%、168%、165%和206%。在葡萄糖培养基中培养4 d后,dxyA-8的FPase酶活、CMCase酶活、PNPCase酶活、PNPGase酶活、木聚糖酶酶活和蛋白分泌量分别是原始菌EU7-22 的 3163%、4719%、3939%、233%、616%和 253%,其中 FPase 酶活和CMCase酶活比EU7-22在诱导情况下的活性还要高,分别达到了 2.55 IU/mL和90.38 IU/mL。以相同体积的在诱导产酶培养基产生的粗酶液水解NaOH/H2O2预处理的大米草,dxyA-8的还原糖释放量是EU7-22的124%。综上所述,本文研究了调控因子Cre2、Acel、Xyr1对东方肉座菌EU7-22产纤维素酶和半纤维素酶的影响,分析了 Cre2和Ace1对该菌产纤维素酶和半纤维素酶的协同作用。克隆了东方肉座菌EU7-22的xyn3基因及其侧翼序列,并以xyn3的启动子和终止过表达了bgl1,获得了高产β-葡萄糖苷酶的工程菌株。最后构建了xyr1和ace3双基因过表达的高产纤维素酶菌株。本文研究为构建东方肉座菌产纤维素酶的工业化菌株奠定了基础。