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玛咖酰胺是玛咖中的一类特征性活性成份,富含玛咖酰胺的玛咖提取物具有抗氧化、提高免疫力和改善生殖健康等多种生物活性。N-苄基二十二碳六烯酸酰胺（N-benzyl docosahexaenoic acid amide,NBDHA）是已发现的玛咖酰胺中不饱和程度最高的一种新型酰胺类化合物,其结构与二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid,DHA）相似。NB-DHA作为一种新型的具有高不饱和度的DHA衍生物,具有潜在的更可观的研究价值。近年来溃疡性结肠炎发病率逐渐升高,成为威胁人类健康的常见疾病,其发病机制与多种因素有关,目前的治疗方法无法获得稳定的疗效,因此需要开发更多安全有效的治疗策略保证治疗效果。研究目的:为了探索该化合物的最佳疾病疗效和药物治疗潜力,也是为溃疡性结肠炎的治疗提供新的思路,本研究基于课题组前期实验优化的合成和纯化方法,自主合成NB-DHA和另一种玛咖中含量最高的玛咖酰胺——N-苄基十六碳酰胺（N-benzyl hexadecanamide,NBH）,并将两种玛咖酰胺应用于右旋葡聚糖硫酸钠（Dextran sodium sulfate,DSS）诱导的小鼠结肠炎模型中;观察NB-DHA对肠炎小鼠发病的影响以及体内Th17/Treg细胞相对数量的改变,并与NBH进行了对比,探索两种典型的玛咖酰胺的药效差异。研究方法:1、NB-DHA与NBH的合成与纯度鉴定利用微藻油和软脂酸为原料,根据皂化反应原理自主合成并纯化两种不同饱和度的玛咖酰胺,依托课题组前期实验结果,采用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography,HPLC）鉴定化合物纯度,并采用液质联用的方法初步鉴定NB-DHA结构。2、NB-DHA与NBH对DSS诱导的小鼠结肠炎的作用研究采用2.5%DSS水溶液诱导C57BL/6小鼠肠炎7 d,于建立模型前3 d开始每天口腔灌胃给药,NB-DHA和NBH的浓度为100mg/kg,柳氮磺胺吡啶（Sulfasalazine,SASP）的浓度为50 mg/kg,造模结束后处死取材。造模期间每日监测每只小鼠体重、粪便隐血情况和活跃状态,计算疾病活动指数。取材时将脾脏称重,计算脾脏指数;制作小鼠结肠组织和脾脏HE切片,观察小鼠结肠病理损伤和脾脏免疫激活情况;运用ELISA方法检测小鼠结肠组织中的细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和髓过氧化物酶（MPO）的浓度。3、NB-DHA与NBH对DSS诱导的结肠炎小鼠肠屏障蛋白及体内Th17/Treg细胞相对数量的影响运用IHC方法原位检测小鼠结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达,并分析灰度值差异;运用流式细胞术检测小鼠肠系膜淋巴结内的Th17、Treg细胞数量比例,应用q PCR技术检测结肠组织中ZO-1、occludin、ROR-γ、Foxp3、IL-10、IL-17A的表达水平。研究结果:1、NB-DHA与NBH的合成与纯度鉴定通过皂化反应与高效液相色谱技术,以DHA鱼油/软脂酸和苄胺为原料合成NB-DHA和NBH单体化合物,并经过高效液相色谱分析得到NB-DHA单体化合物纯度为95%,经过高效液相色谱分析NBH单体化合物纯度为98%。经过液质联用分析得到NB-DHA具有苯环和酰胺键结构,总分子量为417.00。2、NB-DHA与NBH对结肠炎小鼠的预防缓解作用给药结束后,NB-DHA与NBH均能缓解结肠炎带来的体重下降;并且经过疾病活动指数（DAI）的计算,NB-DHA与SASP显著降低评分;NB-DHA和NBH均缓解结肠炎导致的结肠长度缩短;结肠HE染色结果显示,NB-DHA与NBH均减轻了结肠炎的炎性细胞浸润,评分显著降低,且NB-DHA效果优于NBH;ELISA测定结肠组织匀浆上清中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和MPO的浓度,结果显示NB-DHA与NBH均降低TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子的浓度,显著升高IL-10等抗炎因子的浓度,降低了MPO的含量。3、NB-DHA与NBH对结肠炎小鼠的肠道屏障的保护作用免疫组化染色结果显示NB-DHA和NBH均能减少肠粘膜紧密连接蛋白ZO-1和occludin的破坏;q PCR结果显示NB-DHA与NBH均上调了ZO-1和occludin的mRNA表达量,对肠紧密连接蛋白ZO-1和occludin起到一定的保护作用。4、NB-DHA与NBH对结肠炎小鼠Treg/Th17细胞相对数量的影响脾脏HE染色结果显示NB-DHA能够抑制炎症小鼠的免疫过度激活,脾脏指数相对模型对照组降低;流式细胞术结果显示NB-DHA和NBH均能升高Treg细胞相对数量,降低Th17细胞相对数量;q PCR结果显示NB-DHA与NBH能够显著升高Foxp3、IL-10的mRNA表达水平,降低IL-17A、ROR-γ的mRNA表达水平,但NBDHA效果优于NBH,促进炎症消退。研究结论:本研究自主合成了两种玛咖酰胺,其中一种为玛咖中含量最丰富的N-苄基十六碳酰胺（NBH）,另一种为玛咖中不饱和度最高的N-苄基二十二碳六烯酸酰胺（NB-DHA）,纯度均达到了95%以上。进一步探讨了两种化合物对溃疡性结肠炎小鼠的缓解作用,从体重、结肠损伤、肠道屏障紧密连接蛋白和免疫细胞调节方面得到结论,提前给药三天的NB-DHA与NBH均能有效缓解小鼠的结肠炎症,且NBDHA的效果与阳性药物SASP相近,优于NBH。