研究目的:通过多种T细胞分化早期特异性转录因子过表达,诱导终末分化的效应性T细胞去分化,探讨效应性T细胞直接重编程为记忆性T细胞的可行性。研究背景:T细胞治疗回输的基因工程化T细胞因体内增殖和存活能力低下,严重限制了过继性T细胞治疗的长期抗肿瘤效果。有研究发现,T细胞的治疗效果和增殖潜能取决于T细胞的分化状态。处于分化早期的T细胞具有更长的寿命,更强的增殖潜能和重构完整T细胞亚群的能力,因此更适用于过继性免疫治疗。但是,T细胞经过体外刺激扩增最终获得的是数量庞大的效应性T细胞。目前,通过抑制早期T细胞进行性分化和“终末T细胞-诱导性多能干细胞-早期T细胞”两步重编程的策略都难以获得足够数量的分化早期T细胞。因此,尝试通过T细胞分化早期特异性转录因子过表达诱导效应性T细胞逆分化（直接重编程）,能够为获得充足的分化早期T细胞提供全新策略,该研究具有重要的研究意义和潜在的应用价值。研究方法:首先,通过体外转录试剂盒（T7启动子RNA聚合酶）合成能够在T细胞内高效翻译表达的加帽加尾mRNA,并利用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）mRNA进行RNA表达验证和T细胞电穿孔条件优化。然后,利用α-CD3/CD28和高浓度的IL-2体外刺激活化T淋巴细胞,同时导入八个T细胞分化早期特异性转录因子mRNA（LEF1、KLF7、ID3、EOMES、BCL6、TCF7、FOXP1和FOXO1）。紧接着,我们通过RNA测序、T细胞分化特征性表型标志检测和细胞功能实验（如细胞因子ELISA、细胞周期和细胞凋亡）评估诱导效应性T细胞去分化的效果。研究结果:电穿孔优化实验结果表明,最佳的mRNA电转染条件为1μg mRNA 200V 2ms 1pulse。在该条件下,T细胞的转染效率大于90%。通过转录组学分析发现,对照组与共转染组的基因表达模式存在明显差异。表达差异基因的功能主要集中在细胞周期、细胞增殖和效应功能等方面。众多与T细胞早期分化相关的基因出现明显上调（如BCL2、PIM1、E2F1、E2F2等）,而与效应性T细胞效应功能相关的基因则显著下降（如GZMB、PRF1、GNLY、PDCD1等）。更重要的是,转录因子过表达的效应性T细胞表现出与分化早期T细胞（初始T细胞和干细胞样记忆性T细胞）高度相似的基因表达模式。另外,特异性转录因子mRNA同时导入分化成熟的效应性T细胞后,T细胞分化标志性分子出现向早期表型转变的趋势,CCR7表达比例上升,而CD45RO表达比例下降。同时我们还发现,效应性T细胞过表达特征性转录因子后获得了增强的抗凋亡能力,但T细胞效应功能相关的细胞因子分泌水平有所降低（γ-干扰素和α-肿瘤坏死因子）。研究结论:根据以上研究结果,我们初步认为过表达T细胞分化早期特征性转录因子能够诱导效应性T细胞产生向分化早期转变的趋势。