【摘 要】
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气单胞菌是一种广泛存在于水生环境中的人-畜-水生动物共患致病菌,DNA条形码可实现对气单胞菌的高效准确鉴定,为合理选择抗感染治疗用药提供科学准确的依据。频繁爆发的气单胞菌感染性病害严重危害人类健康,同时限制了养殖行业的发展。了解宿主免疫应答过程中发挥重要功能的基因和通路,探究免疫应答关键基因的序列结构信息可为药物靶点的发现与抗菌药物的研发提供研究基础,为致病菌的综合防治提供新思路。实验以33株气单
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气单胞菌是一种广泛存在于水生环境中的人-畜-水生动物共患致病菌,DNA条形码可实现对气单胞菌的高效准确鉴定,为合理选择抗感染治疗用药提供科学准确的依据。频繁爆发的气单胞菌感染性病害严重危害人类健康,同时限制了养殖行业的发展。了解宿主免疫应答过程中发挥重要功能的基因和通路,探究免疫应答关键基因的序列结构信息可为药物靶点的发现与抗菌药物的研发提供研究基础,为致病菌的综合防治提供新思路。实验以33株气单胞菌为材料,利用设计的通用引物PCR扩增不同菌株的ppsA、recA和cpn60基因,获得序列的测序信息并分析。以PCR扩增成功率和测序成功率、遗传距离、DNA barcoding gap和系统发育树为评价标准,筛选通用性好、准确度高的条形码基因。我们发现cpn60基因的变异位点碱基占总碱基数比例最高,为27.68%,可提供更多的物种分辨信息;cpn60基因中97.9%序列的种内遗传距离小于0.04,而98.1%的序列种间遗传距离要大于0.04,且cpn60的种间遗传距离为13.3%,显著大于其种内遗传距离1.7%,条形码间隔比较明显,能有效地区分同属内的不同菌种。而recA基因的平均种间遗传距离为0.049,虽然也大于其平均种内遗传距离0.023,但recA基因出现了较大程度的遗传距离的重叠,没有出现非常明显的条形码间隙。而ppsA基因扩增测序成功率过低,通用性差,无法用于气单胞菌的鉴定。综上,cpn60基因可作为气单胞菌属的DNA条形码鉴定不同菌种。为探究宿主对病原刺激的免疫反应,我们对人工感染维氏气单胞菌24 h后的锦鲤脾脏进行了转录组测序。共筛选到373个差异表达基因（DEGs）,其中240个基因表达上调,133个基因表达下调。与炎症小体密切相关的NLRP3、CD11b、CD11c和IL-1β的表达水平显著上调。进一步的注释和富集分析表明,DEGs主要富集于吞噬体、细胞粘附分子、IL-17信号通路和抗原的加工和呈递。上述分子和信号通路可能在清除外来入侵病原体中发挥重要作用。为了验证RNA-seq数据的准确性,选取10个与免疫相关的基因进行RT-qPCR实验,结果表明它们的表达与RNAseq数据高度一致。此外,RT-qPCR也证实了与NLRP3炎性小体组装与激活相关的基因caspase-1、caspase-3、caspase-9、CARD以及ASC基因均表达上调,表明维氏气单胞菌的感染显著诱导宿主脾脏组织NLRP3炎性小体的组装和成熟。TLR4（Toll-like receptor 4）是脂多糖的主要受体,被刺激后可导致一系列炎症因子的释放,激活免疫应答。我们克隆得到锦鲤TLR4基因序列,其c DNA序列全长为1237 bp,开放阅读框为432 bp,编码143个氨基酸。生物信息学软件预测锦鲤TLR4氨基酸序列的分子量为16114.2,理论等电点为5.87。在与其他物种的比对中,锦鲤TLR4和鲤鱼TLR4的氨基酸序列相似性最高,为98.43%,表明锦鲤与同属的鲤鱼亲缘关系最近。组织表达分析显示,TLR4基因在免疫器官脾脏和肠中的表达量分别是肌肉组织的789倍和466倍。
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