原发免疫性血小板减少症（primary immune thrombocytopenia,pITP）,既往又称为特发性血小板减少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP）,是一种自身免疫性介导的出血疾病,临床症状是外周血小板减少、粘膜皮肤出血和内脏出血。潜在的出血风险严重影响了患者的生活质量,ITP的一线治疗主要包括糖皮质激素,抗D免疫球蛋白和静脉注射免疫球蛋白,但治疗的远期效果也不尽如人意,仍有很多患者不能获得持续缓解。迄今为止ITP发病机制复杂并且尚未完全阐明,除了抗体介导引起血小板破坏外,异常的细胞免疫也影响了 ITP的发病机制。当前由于自身免疫耐受缺陷导致的免疫异常失衡可以被作为ITP发病的中心环节,因此深入探究导致ITP免疫失衡的因素对于认识ITP的发病机制具有重要意义。DNA甲基化作为最常见的表观遗传修饰形式的一种,异常的DNA甲基化可以影响相关基因的表达,导致T细胞的分化,增殖和凋亡发生改变,可能会引起自身免疫性疾病的发生。甲基化缺陷诱导相关基因异常表达可参与自身反应性免疫反应,最终加速免疫性血小板减少症的进展。此外,细胞凋亡也是近年来ITP发病机制研究的重点,细胞凋亡可能导致体液和细胞免疫的破坏或功能抑制,而且通过巨核细胞凋亡也会促进血小板破坏和血小板产生减少。深入探究在ITP中发挥关键作用的凋亡相关蛋白,可对探索ITP的发生机制,为寻找治疗途径奠定重要的基础。因此,本研究应用甲基化测序以及蛋白组学技术对ITP异常甲基化基因和凋亡相关蛋白进行了分析及验证。第一部分:通过甲基化分析探究ITP中关键甲基化基因和通路。目的:已知DNA甲基化在ITP的发生、发展中发挥重要作用,我们进一步探索ITP的关键甲基化基因及其相关通路,为后续的精准治疗提供新的思路。方法:通过全基因组甲基化技术,对21例ITP患者和9例正常对照样本进行了甲基化测序,得到差异表达的甲基化位点和甲基化区域,并对其进行注释。将差异甲基化区域的注释结果与Phenopedia数据库和DisGeNET数据库交叉分析,得到ITP相关的差异甲基化基因。对这些基因进行GO和KEGG富集分析,寻找关键的基因和信号通路。结果:我们一共得到了 16个与ITP相关的差异甲基化基因,分别是ABCC3、AQP1、C4BPB、DNMT3B、FGFR3、NOTCH1、RET、SH2B2、SLC19A1、SLC4A11、SNRNP70、TYK2、ZMPSTE24,TPO、TCIRG1,以及LTA。对这16个基因进行KEGG富集分析,发现一条ITP中重要的免疫相关通路——Th1和Th2细胞分化通路。同时,高甲基化NOTCH1参与该通路的表达并调控下游许多细胞因子。结论:异常的高甲基化基因NOTCH1可以通过Th1和Th2细胞分化通路调节许多下游细胞因子进而起到影响ITP的作用。第二部分:去甲基化药物通过影响NOTCH1以及相关通路起到治疗ITP的作用。目的:已知关键基因NOTCH1在ITP中表达异常高甲基化,明确去甲基化药物（地西他滨）通过降低NOTCH1的甲基化以及调节下游Th1和Th2细胞因子,从而具有治疗ITP的作用。方法:使用RT-PCR和Luminex技术检测NOTCH1以及Th1和Th2细胞分化通路上的细胞因子在ITP的表达情况,以验证高甲基化NOTCH1表达下降并影响下游细胞因子的表达。另外,我们提取ITP患者的骨髓单个核细胞,实验组加入地西他滨,对照组加入PBS进行细胞培养,通过RT-PCR、ELISA和流式细胞术检测NOTCH1和相关细胞因子的表达,来验证地西他滨治疗ITP的有效性。结果:与正常对照组相比,ITP组的NOTCH1及其下游Th2细胞因子表达水平显著降低,且成正相关;而Th1细胞因子表达水平显著升高,与NOTCH1成负相关。同时,使用药物地西他滨可以逆转ITP中NOTCH1及其下游细胞因子的表达,与加入PBS的ITP组相比,加入地西他滨的ITP组中NOTCH1和Th2细胞因子表达显著升高,而Th1细胞因子表达显著下降。结论:异常的高甲基化NOTCH1的低表达可以引起Th2细胞因子表达下调而Th1细胞因子表达上调。地西他滨可以使NOTCH1表达升高,进而改善Th1和Th2细胞因子间的失衡,对ITP有良好的治疗效果。第三部分:蛋白质组学分析发现ITP中异常表达的凋亡相关蛋白及通路。目的:探究ITP中新的关键凋亡蛋白和相关信号通路,以发现凋亡在ITP发病的新机制。方法:我们收集了 20例ITP患者和20例健康对照组的骨髓样本,采用蛋白质组学技术来分析异常差异表达蛋白质和蛋白质的互作网络,以发现ITP中的凋亡相关蛋白及其相互关系。再使用平行反应监测（PRM）定量分析已鉴定的目标蛋白,验证蛋白质组学结果。结果:我们共鉴定出829个蛋白;通过与正常对照比较,ITP组中共有26个蛋白表达上调,69个蛋白表达下调。生物信息学分析表明:下调的差异表达蛋白（HSPA6,HSPA8,ITGB3,YWHAH,和PRDX6）与细胞凋亡相关,并可以通过PI3K-Akt信号通路影响ITP。而且蛋白互作网路中显示这些蛋白可以相互作用,互为沟通。同时PRM的结果再次证实了 ITP患者的凋亡相关蛋白（HSPA6,HSPA8,ITGB3,YWHAH,和PRDX6）显著降低。结论:下调的凋亡相关蛋白（HSPA6,HSPA8,ITGB3,YWHAH,和PRDX6）通过PI3K-Akt信号通路与ITP的发病机制密切相关。