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目的:通过表达水平检测和生物信息学软件将Galectin-9与microRNA建立联系,验证miR-22对Galectin-9的靶向调控作用,并研究miR-22-Galectin-9途径对肿瘤细胞和淋巴细胞增殖凋亡情况以及细胞因子水平的影响。 方法:生物信息学分析软件预测Galectin-9其潜在相关microRNA,qRT-PCR和Western blot方法检测表达水平。转染microRNA mimics和Galectin-9-3’UTR荧光素酶报告基因质粒对miR-22与Galectin-9的靶向调控关系进行验证。HepG2细胞与PBMC共培养,WST-1方法检测各组HepG2细胞的增殖情况,Annexin-V-Fluos试剂盒流式细胞术检测淋巴细胞的凋亡情况,qRT-PCR检测细胞因子IL-2和IFN-γmRNA的表达水平。 结果:生物信息学软件预测miR-22可能对Galectin-9存在靶向调控作用,且肝癌细胞中Galectin-9表达升高,miR-22表达显著降低。miR-22通过直接与Galectin-93’UTR结合,在转录后水平下调Galectin-9的表达。miR-22-Galectin-9途径影响共培养体系中肿瘤细胞增殖和淋巴细胞凋亡以及细胞因子的产生,可能参与肝癌细胞的免疫逃逸过程。 结论:miR-22下调Galectin-9参与肝癌的免疫逃逸过程。 第一部分 Galectin-9及其潜在相关microRNA在肝癌中的表达 目的:检测Galectin-9在肝癌细胞与正常肝细胞中的表达水平,生物信息学软件预测可能与其存在靶向调控关系的microRNA,并检测它们在肝癌中的表达情况,确定重点研究靶向关系的一种microRNA。 方法:培养人正常肝细胞Lo2和肝癌细胞HepG2、SMMC7721,收集一定数量的细胞,提取RNA和蛋白质,qRT-PCR和Western blot方法分别检测Galectin-9在mRNA和蛋白水平的表达情况。使用生物信息学分析软件miRanda(http://www.microrna.org)和TargetScan(http://www.targetscan.org/)预测可能与Galectin-9存在靶向调控关系的microRNA,选择miR-22、296-3p、455-5p和491-5p,qRT-PCR法分别检测它们在正常肝细胞和肝癌细胞中的表达水平。武汉协和医院肝胆外科查阅病人临床病例和病理参数,收集肝癌患者肝癌组织和对应癌旁组织标本,提取RNA,检测miR-22在肝癌组织中的表达水平。 结果:Galectin-9 mRNA和蛋白在肝癌细胞中的表达水平高于正常肝细胞,尤其是在HepG2细胞表达最高。生物信息学软件预测miR-22、296-3p、455-5p和491-5p可能与Galectin-9存在靶向调控关系,其中miR-22和miR-491-5p在肝癌细胞比正常肝细胞中表达低,miR-22表达差异最显著。同时,miR-22在肝癌组织的表达水平也是明显低于相应的癌旁组织。 结论:生物信息学软件预测miR-22可能对Galectin-9存在靶向调控作用,且肝癌细胞中Galectin-9表达升高,miR-22表达显著降低,为进一步验证两者之间的靶向关系奠定基础。 第二部分 Galectin-93’UTR荧光素酶报告基因质粒的构建和miR-22对Galectin-9直接靶向调控关系的验证 目的:构建Galectin-93’UTR荧光素酶报告基因质粒,验证miR-22对Galectin-9的靶向调控作用。 方法:将miR-22 mimics和Control mimics分别转入肝癌细胞HepG2中,24小时后,荧光显微镜下观察microRNA mimics的转染效率并qRT-PCR检测miR-22的表达差异,同时检测Galectin-9的mRNA和蛋白表达水平,与未转染组细胞中的表达水平进行对比,分析Galectin-9表达的变化。基因工程方法构建pCMV-Galectin-93’UTR野生型和变异型荧光素酶报告基因质粒,分别与miR-22 mimics和Control mimics共转入HepG2细胞,24小时后,使用双荧光检测试剂盒检测各组细胞的荧光强度。 结果: microRNA mimics转染效率约60%,转染miR-22 mimics的HepG2细胞与转染Control mimics和未处理组相比,miR-22表达上调,Galectin-9 mRNA表达水平无明显差异,蛋白表达明显降低。Galectin-93’UTR荧光素酶报告基因质粒构建成功,荧光素酶报告基因检测结果显示,共转miR-22 mimics和pCMV-Galectin-93’UTR野生型质粒的细胞中,荧光强度明显较其他三组低。 结论:miR-22与Galectin-9存在靶向调控关系,miR-22通过直接与Galectin-93’UTR结合,在转录后水平下调Galectin-9的表达。 第三部分 miR-22-Galectin-9途径在肝癌免疫逃逸中的作用 目的:研究miR-22-Galectin-9途径对肿瘤细胞和淋巴细胞增殖凋亡情况以及细胞因子水平的影响,探究该途径参与肝癌细胞免疫逃逸的分子机制。 方法:HepG2细胞分为未转染组(阴性对照组)、转染Galectin-9过表达载体组、转染miR-22 mimics组和Galectin-9过表达载体-miR-22 mimics共转组,健康供者抽取静脉血,Ficoll淋巴细胞分离液作密度梯度离心提取外周血单个核细胞(PBMC),然后将上述各组HepG2细胞分别与PBMC共培养,48小时后WST-1方法检测各组HepG2细胞的增殖情况,Annexin-V-Fluos试剂盒流式细胞术检测淋巴细胞的凋亡情况,qRT-PCR检测细胞因子IL-2和IFN-γmRNA的表达水平。 结果:转染Galectin-9过表达载体组,HepG2细胞增殖数目、PBMC凋亡率高于阴性对照组,IL-2、IFN-γmRNA的表达水平低于阴性对照组。转染miR-22 mimics组,HepG2细胞增殖数目低于阴性对照组,PBMC凋亡率与阴性对照组未发现明显差异,细胞因子IL-2的表达水平与正常对照组无明显差异,而IFN-γ的表达水平高于正常对照组。共转Galectin-9过表达载体和miR-22 mimics组,HepG2细胞增殖数目及IL-2、IFN-γmRNA的表达水平与阴性对照组无显著性差异,PBMC凋亡率低于转染Galectin-9过表达载体组, IL-2的表达水平高于转染Galectin-9过表达载体组。 结论:miR-22-Galectin-9途径影响共培养体系中肿瘤细胞增殖和淋巴细胞凋亡以及细胞因子的产生,可能参与肝癌细胞的免疫逃逸过程。