论文部分内容阅读
第一部分14,15-EET促进颅骨缺损骨再生研究目的:通过建立C57BL/6小鼠颅骨标准骨缺损模型来研究14,15-EET(14,15-epoxyeicosatrienoicacid,14,15-环氧二十碳三烯酸)能否促进骨再生,为骨组织再生研究提供新思路。研究方法:C57BL/6小鼠颅中缝两侧建立直径5 mm的全层颅骨圆形缺损。将小鼠一侧缺损作为实验侧,另一侧作为对照侧。术后第3天于小鼠实验侧缺损处局部皮下注射14,15-EET(10μM),对照侧缺损处皮下注射等量PBS,隔日注射,持续4周。术后8周将小鼠处死,CBCT放射诊断观测缺损面积大小,HE染色和Masson三色染色分析新骨形成及相关组织结构,免疫组织化学染色分析CD31的表达情况。研究结果:术后8周小鼠实验侧缺损面积比对照侧减小,差异有统计学意义(p<0.05);实验侧缺损区新生骨量和新生血管数均较对照侧增多,差异有统计学意义(P<0.05);Masson三色染色结果显示实验侧颅骨缺损区可以明显观察到再生骨、骨质及胶原纤维,而对照侧不明显。此外,实验侧颅骨缺损区CD31表达量高于对照侧,差异有统计学意义(p<0.05)。结论:通过提高局部14,15-EET水平可促进颅骨缺损区新生骨及新生血管的形成,推测14,15-EET促进骨再生可能与其改善局部微循环相关。第二部分可溶性环氧化物水解酶抑制剂促进颅骨缺损骨再生研究目的:解决炎症、免疫、和营养供应是基于干细胞的骨组织工程技术面临的现实问题,考虑到环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acid,EETs)体内半衰期短,易降解,本研究通过可溶性环氧化物水解酶抑制剂(soluble epoxide hydrolase inhibitor,sEHi)抑制EETs水解来提高内源性EETs水平。首先通过体外实验研究 sEHi 对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖和分化的影响,然后通过体内实验研究sEHi能否促进BMSCs骨再生。研究方法:体外实验,首先利用CCK8法来研究sEHi对BMSCs增殖的影响;其次将BMSCs用成骨条件培养基诱导培养检测sEHi对BMSCs的成骨分化的影响,利用ALP活性测试盒检测ALP活性,茜素红-S(AR-S)染色检测钙化沉积,q-PCR检测BMSCs在成骨诱导前后ALP、Runx2、OPN基因在mRNA水平的表达情况。体内实验,C57BL/6小鼠颅中缝两侧建立直径5 mm的全层颅骨圆形缺损,小鼠实验侧缺损处植入用sEHi预处理的BMSCs和β-TCP的混合物,对照侧植入未用sEHi处理的BMSCs和β-TCP的混合物。术后第3天于实验侧缺损处局部皮下注射sEHi(10 μM),对照侧缺损处皮下注射等量PBS,隔日注射,持续4周。术后8周将小鼠处死,CBCT放射诊断观测缺损面积大小,HE染色和Masson三色染色分析新骨形成及相关组织结构,免疫组织化学染色分析血管内皮生长因子(Vascular endothelia growth factor,VEGF)的表达情况。研究结果:体外研究显示sEHi对BMSCs增殖并无明显的影响;ALP活性检测、AR-S染色和q-PCR检测结果显示,sEHi对BMSCs骨向分化也无明显的影响,且无统计学差异。体内实验表明,术后8周小鼠实验侧缺损新骨形成较对照侧增多,差异有统计学意义(p<0.05);Masson三色染色结果显示实验侧颅骨缺损区可以明显观察到再生骨、骨质和胶原纤维,而对照侧不明显;此外,实验侧颅骨缺损区VEGF表达量高于对照侧,差异有统计学意义(p<0.05)。结论:1.sEHi对骨髓间充质干细胞的增殖和骨向分化均无明显影响。2.通过提高局部sEHi水平可促进颅骨缺损区新生骨形成及VEGF产生,我们推测该现象可能是通过外源性给予sEHi后进而提高了内源性EETs水平而实现的,该研究进一步证实了前期研究成果,有望用于骨组织再生研究。