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第一部分骨髓间充质干细胞共培养对H2O2损伤PC12细胞的保护作用 目的: 通过体外MSCs与H2O2损伤的PC12细胞共培养模型，阐明MSCs通过降低凋亡，调节细胞因子分泌，从而对H2O2损伤的PC12细胞发挥神经保护作用，并初步探讨其中TLR2相关信号通路的作用。 方法: 采用不同浓度的H2O2(1.0mM，2.5mM，5.0mM)损伤PC12细胞1h，同时以未处理PC12细胞作为对照组，MSCs共培养采用混合培养24h。MTS检测共培养前后PC12细胞的存活能力，LDH含量测定和NO释放实验分析H2O2对神经细胞的毒性作用，Annexin-V-EGFP-PI双染试剂盒检测PC12细胞的凋亡情况，钙影像系统检测胞内Ca2+变化，全细胞膜片钳检测PC12细胞的静息膜电位，RT-PCR测定Bcl-2和caspase-3凋亡相关基因mRNA水平表达变化，ELISA试剂盒检测损伤微环境中相关细胞因子的分泌变化，Western Blotting分析TLR2及其信号通路下游核因子NFκB的表达水平。 结果: (1)经RT-PCR检测，PC12细胞表达神经相关标志MAP-2、NSE和Nestin，免疫荧光结果同样显示PC12细胞内有MAP-2表达。(2)形态学观察发现H2O2浓度为1.0mM组的细胞损伤最轻，与正常对照组相比基本无差别;但随着H2O2浓度的增高，细胞损伤程度逐渐加重。MSCs共培养组细胞形态学提示MSCs促进了神经细胞损伤的修复。(3) MTS分析结果显示，2.5mM和5.0mM组细胞的存活能力较正常对照组分别降低了50％和75％(P＜0.05 vs.control组)，而1.0mM组与对照组相比没有显著性差异;MSCs共培养组与其他共培养组（条件培养基共培养组和PC12细胞共培养组）相比，细胞的存活能力更强。(4)在LDH检测实验中，三组经不同浓度H2O2处理的细胞中LDH的分泌均有增加，与未处理组相比均具有统计学差异(P＜0.05 vs.control组);PC12细胞损伤后的MSCs共培养组比未损伤共培养组中释放的LDH略有增加，但是与PC12单独损伤组相比，LDH增加的幅度减少(P＜0.05 vs.control组)。(5) NO释放测定结果同样表明，各组H2O2不同处理中的NO含量均高于正常对照组，但仅有5.0mM组与对照组之间存在显著性差异(P＜0.05 vs.control组)。在损伤后MSCs共培养组中，NO的浓度却显著低于未损伤共培养对照组，两组间存在统计学差异(P＜0.05 vs.control组)。(6) Annexin-V-EGFP-PI的免疫荧光结果显示，随着H2O2浓度的增高，红色标记的细胞核逐渐增多;而在MSCs共培养组中基本未见中晚期凋亡的红色荧光，仅有EGFP标记早期凋亡的绿色荧光出现，并随着H2O2浓度的增高逐渐增多。(7)钙影像检测系统的结果发现，外源性的NMDA可诱导未损伤的PC12细胞胞内Ca2+发生急剧性地外流，而1.0mM和2.5mM H2O2损伤组却对NMDA的刺激没有反应。通过MSCs与损伤PC12细胞共培养后，NMDA刺激可引起2.5mM和5.0mM两组细胞胞内钙缓慢降低，与对照组相比具有统计学差异(P＜0.05)，但1.0mM组与对照组之间没差别。(8)细胞膜片钳结果显示MSCs共培养后2.5mM组较共培养前有更大的静息膜电位，共培养体系中1.0mM组和2.5mM两组较未损伤共培养组具有更大的负值膜电位(P＜0.05);而单独损伤各组间无显著性差异。(9) RT-PCR结果显示，在不同浓度H2O2损伤PC12细胞的各组之间Bcl-2和caspase-3 mRNA表达变化不大，差异无统计学意义;但在损伤PC12细胞与MSCs共培养组，2.5mM和5.0mM组中Bcl-2mRNA表达水平显著高于未损伤共培养组(P＜0.05)，而1.0mM组和对照组相比无明显差异。与此相反，caspase-3 mRNA的表达水平在5.0mM-共培养组中呈明显下降趋势。(10) ELISA结果发现，IL-10的分泌在单独的PC12细胞损伤组随着H2O2浓度的增加而逐渐增高，而在共培养组则逐渐降低;IL-6的分泌水平在MSCs共培养组呈现整体剧增趋势;共培养前后损伤微环境中TNF-α、IFN-β、IL-8和NGF等因子的分泌情况在各组间无统计学差异。(11)Western Blotting检测显示:单独损伤组随着H2O2浓度增高，TLR2的表达稍有增强;MSCs共培养后各组TLR2表达水平则逐渐减弱。并且发现NFκB P65的表达趋势与之相同。 结论: (1) MSCs共培养提高了受损伤PC12细胞的存活能力，同时显著降低了细胞凋亡和坏死，对损伤细胞具有神经保护作用。(2)MSCs可上调Bcl-2、下调caspase-3，同时分泌IL-6调节IL-10的分泌，促进PC12细胞损伤的修复。(3) MSCs改善损伤PC12细胞的修复机制可能是通过TLR2→NFκB信号通路调节下游细胞因子的分泌，在损伤局部微环境中发挥免疫调节作用。 第二部分 TLR2在骨髓间充质干细胞移植治疗缺氧缺血性脑损伤中的调节作用 目的: 明确MSCs移植通过调节TLR2信号通路促进HIBD大鼠脑损伤的修复;阐明TLR2信号通路在HIBD过程中的免疫调节作用。 方法: 将180只大鼠随机分为假手术组（sham组）、HIBD造模组、MSCs移植治疗HIBD组（MSCs组）及给予Pam3CSK4干预后HIBD造模组（Pam3CSK4组）。在大鼠7日龄时采用Rice法结扎并离断实验大鼠的左颈总动脉，sham组仅进行颈部皮肤切开后缝合，Pam3CSK4组在HIBD损伤前16h经腹腔注射给予Pam3CSK430μg/只，MSCs组则在HIBD损伤后24h以腹腔注射方式给予原代培养的MSCs1.5×106cells/只。Morris水迷宫检测实验动物的学习记忆功能;Real-timePCR和Western Blotting方法检测HIBD后不同时间点各组大鼠损伤侧海马组织中TLR2的表达变化，并比较分析HIBD与Pam3CSK4两组间TLR2及其相关信号通路因子、凋亡因子Bax的表达情况;ELISA试剂盒测定大鼠损伤侧海马组织中IL-10的分泌水平。 结果: (1) Morris水迷宫实验发现，HIBD组实验大鼠寻找平台的潜伏期显著长于sham组(P＜0.05 vs.sham组)，而经MSCs移植治疗的实验大鼠寻找平台所用时间则介于sham组和HIBD组之间，与sham组及HIBD组均有显著性差异（P＜0.05）;在第6d的平台探索实验中，HIBD组实验大鼠停留在平台所在象限的平均时间明显短于sham组，MSCs组则介于两者之间，与HIBD组及sham组之间的差异均有统计学意义（P＜0.05）。(2)同时发现，随着损伤时间（3d、7d和14d）的延长，HIBD组实验大鼠损伤侧海马组织中TLR2的表达逐渐增强。在对同一时间点不同处理三组（正常对照组、HIBD造模组和MSCs回输组）进行比较，发现HIBD组TLR2的表达水平较sham组高（P＜0.05 vs.sham组）;而MSCs组与HIBD组相比，TLR2的表达水平却呈下降趋势（P＜0.05 vs.HIBD组）。(3) HIBD组大鼠损伤侧海马组织中IL-10分泌水平明显高于sham组(P＜0.05)，而MSCs移植治疗降低了损伤侧海马组织中IL-10的水平(P＜0.05)。(4)相较于HIBD组大鼠，TLR2特异性激动剂Pam3CSK4显著增加了HIBD实验大鼠寻找平台的潜伏期，并降低了损伤大鼠在平台所在象限停留的平均时间，同时增强了损伤侧海马组织中TLR2、NFκB和Bax的表达水平，并使IL-10的分泌增加。 结论: MSCs移植通过下调TLR2的表达，降低TLR2信号通路关键核因子NFκB的表达，减少凋亡因子Bax的表达水平及IL-10的分泌，从而促进HIBD模型大鼠学习记忆功能的修复。