【背景及目的】海军作为我国重要的军事战斗力量,其战略地位越来越高,同时随着海上运输、渔业等海上活动发展,与海水相关的四肢创伤的发病率随之越来越高。因此针对海水细菌感染的肢体创伤开始受到重视,但是海水细菌相关研究还处于初步阶段,相比于海洋科学的其他分支而言相对落后,国内对海水细菌群落组成分析调查较少,关于四肢创伤合并海水细菌感染的相关动物模型也更少,本研究通过结合“Illumina Mi Seq测序+细菌培养”方法全面分析东南沿海海域海水细菌的组成,在此基础上构建兔胫骨海水细菌感染的新模型,旨在为海洋科学和临床医学提供基础资料和实验方法。【方法】实验一:东南沿海海域海水细菌群落的组成分析。在东南沿海海域现场采样并进行海水环境因子测量:包括温度、PH、渗透压、Na+、K+、Ca2+离子浓度。利用抽滤系统用滤膜（孔径0.22μm,直径50mm,水系MCE）过滤500ml海水,将海水滤膜随机分为4组:海水总细菌群落组8片,海水活性细菌群落组3片,海水细菌培养组8片,实验组10片。海水总细菌群落组和海水活性细菌群落组经Illumina Miseq测序法分别进行16S r DNA、16S r RNA基因（V3-V4区域）的DNA、RNA提取,再进行PCR扩增、测序和序列处理,最后进行统计学分析。海水细菌种类繁多,根据不同的生长要求利用8种细菌培养平板进行培养、分离、鉴定和计数。实验二:兔胫骨海水细菌感染模型的构建。将14只新西兰兔随机1-14编号后分为2组:实验组10只（其中编号EG13在麻醉时死亡）,对照组3只。将每只实验兔麻醉后测量体内相关指标:包括体温、血生化(PH值、渗透压、Na+、K+、Ca2+离子浓度)。所有动物制备左侧胫骨骨缺损模型后,实验组将10片海水滤膜分别放入每只动物胫骨骨髓腔中,对照组则放入同种无菌滤膜,进行骨蜡封口、缝合等。术后常规护理,术后1周通过大体情况、统计感染率和死亡率、骨髓腔内感染细菌的基因测序、微生物培养及药敏实验、骨髓腔组织病理学和扫描电镜观察进行全面评估和分析。【结果】实验一:我国东南沿海海域海水细菌基因测序结果表明:海水总细菌群落组和海水活性细菌群落组在门水平的高丰度细菌均以蓝藻门（Cyanobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）为主,在纲水平以产氧光细菌纲（Oxyphotobacteria）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）为主,在属水平以Synechococcus＿CC9902、Chloroplast、Cyanobium＿PCC-6307为主。Beta多样性分析和物种差异分析表明海水总细菌群落和活性细菌群落之间有明显差异性（P<0.05）,主要为低丰度细菌的差异。8份海水滤膜分离出9种53株细菌:其中弧菌属20株（37.74%）,肠杆菌属22株（41.51%）,非发酵菌属11株（20.75%）。此项调查不仅对海水细菌感染诊治有利,还对防止海水细菌导致的传染病流行有重要意义。实验二:术后1周:1、实验组感染率100%、死亡率20%,对照组感染率和死亡率均为0,两组对比感染率差异有统计学意义（P0.05）,表明实验模型构建稳定性良好。2、实验组骨髓腔感染的活性细菌基因测序结果表明:在门水平以厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、热袍菌门（Thermotogae）为主,在纲水平以梭菌纲（Clostridia）、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、热袍菌纲（Thermotogae）为主,在属水平以Clostridium＿sensu＿stricto＿7、Haloimpatiens、Clostridium＿sensu＿stricto＿15为主。通过样本层级聚类分析、PCo A分析、ANOSIM分析和组间差异显著性检验都表明实验组和海水组、实验组和对照组之间的细菌群落组成均有统计学差异（P<0.05）。另外对实验组和海水组的海洋细菌因生存环境的变化而改变进行环境因子关联分析:包括排序回归分析和相关性Heatmap图分析,结果表明海水组的大部分优势菌与PH值、渗透压以及Na+、K+和Ca2+离子浓度呈正相关,与温度呈负相关,实验组则相反。不可忽略骨髓腔的缺氧环境使海水中劣势菌群中的梭菌属成为主要的致病菌。3、10只实验组动物感染标本分离出11类45株细菌,其中弧菌属5株（11.11%）,肠杆菌属21株（46.67%）,非发酵菌属10株（22.22%）,革兰阳性球菌属9株（20.00%）,与海水组、对照组细菌培养结果相比差异均有统计学意义（P<0.05）。4、通过药敏实验得出感染细菌的耐药及敏感抗生素,为海洋细菌感染的治疗用药提供科学依据。5、应用RT-PCR测量载入兔胫骨平均海洋活性细菌数为1.6711x10~8copies/ml;实验组平均感染活性细菌数为1.609x10~7copies/ml。6、组织病理学评估:实验组样本处理及HE染色后,显微镜下观察均为阳性感染表现,与大体观察、感染细菌基因测序、微生物学评估结果相对应,而对照组病理未见感染征象。7、扫描电镜观察:实验组可见大量细菌附着在骨髓腔表面及深部,形态学表现为短杆粗状、长杆细状、球状、纺锤状、梭形等,细菌之间可见大量分泌物附着。由此我们对兔胫骨海水细菌感染模型进行了全面评估,并且验证了模型的可行性、科学性和可靠性。【结论】1、本实验首次应用“Illumina Mi Seq测序+细菌培养”方法深入研究我国东南沿海海域海水细菌的种类和组成,对比了海洋总细菌和活性细菌的差异性,为进一步研究水生态系统中的微生物群落提供基础资料。2、本实验首次利用滤膜抽滤海水富集细菌的新方法,并将其载入兔胫骨骨髓腔成功构建兔胫骨海水细菌感染新模型,该模型分别从感染细菌的基因检测、细菌培养、组织病理学和扫描电镜观察四个方面进行全面评估。利用RT-PCR方法完成细菌载入量测定后进一步比较研究,包括完善海洋活性细菌分别在海水及实验动物体内两种不同的环境下群落种类及组成的变化,揭露海水致病菌的致病环境,分析溶藻弧菌作为条件致病菌的致病条件,提出重视海水细菌感染后发生厌氧菌感染的情况,最后对致病菌进行药敏试验,提倡应用碳青霉烯类抗生素进行联合、足量、全程使用。为海洋科学、基础医学、临床诊治相关病人提供一定的科学依据,也为我国海军、渔业等提供一定的后勤保障基础。