铜绿假单胞菌是一种自然环境中常见的致病菌,当动物机体面对条件性的应激因素例如注射污染、疲劳运输、皮肤烧伤等时极易受到铜绿假单胞菌的感染。虽然长期以来,针对本病的控制手段一直以抗生素疗法为主,但由于铜绿假单胞菌广谱耐药的情况出现,因此亟待采用更为合理的防控与处理手段。人们一直期望能够找到预防和抑制该细菌侵染的有效手段,来遏制铜绿假单胞菌发病率上升的势头。因此研制出新型安全高效的铜绿假单胞菌疫苗具有重要的意义。1.DNA疫苗的构建:本研究选择铜绿假单胞菌外膜蛋白D基因和真核表达载体p CAGGS-HA构建DNA疫苗,首先设计特异性引物,通过PCR扩增出大小为1340 bp的目的基因oprD,将目的基因连接于p MD（?）19,通过限制酶SacⅠ和NheⅠ双酶切oprD基因和真核表达载体p CAGSS-HA,用T4连接酶连接后得到阳性重组子p OPRD,成功构建DNA疫苗。2.原核表达载体的构建及重组蛋白的表达与纯化:本研究选择铜绿假单胞菌外膜蛋白D基因和原核表达载体p ET32a构建基因工程亚单位疫苗。重新设计特异性引物,通过PCR扩增出大小为1340 bp的目的基因oprD,将目的基因连接与p MD（?）19,通过限制酶Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切oprD基因和原核表达载体p ET32a,T4连接酶连接后得到阳性重组子p ET32a-oprD,将构建成功的原核表达载体p ET32a-oprD转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,IPTG成功诱导出65k D大小的Opr D重组蛋白。探索了Opr D蛋白最佳诱导表达条件是菌液培养5 h时加入0.7 mmol/L的IPTG,37℃下诱导4.5 h。3.DNA疫苗与重组亚单位疫苗免疫效果的研究:根据试验设计准备了七组疫苗组对小鼠进行免疫试验,检测不同疫苗组的免疫应答效果,七组疫苗组分别是DNA疫苗组、重组亚单位疫苗组、初免-加强免疫组（p OPRD初次免疫-重组亚单位疫苗加强免疫组）、外膜蛋白疫苗组、灭活疫苗组、p CAGGS-HA组和PBS组。试验结果显示,随着免疫次数的增加,各疫苗诱导的小鼠血清抗体水平均呈现出明显的上升趋势,试验组疫苗均可产生较高水平的血清抗体,对小鼠产生较高水平免疫保护;脾淋巴细胞增殖试验显示初免-加强免疫组和外膜蛋白疫苗组小鼠三免后的SI值显著高于其他疫苗组（P＜0.05）;细胞因子IFN-γ分泌试验显示初免-加强免疫组小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ浓度显著高于其他各组（P＜0.05）,而细胞因子IL-4分泌试验也显示初免加强免疫组和外膜蛋白疫苗组的IL-4浓度显著高于其他疫苗组（P＜0.05）;攻毒试验结果初免-加强免疫组保护率73.3%较重组亚单位疫苗组和DNA疫苗组单独免疫时保护效果更好。本研究对铜绿假单胞菌外膜蛋白oprD基因的DNA疫苗（p OPRD）和基因工程亚单位疫苗（外膜蛋白Opr D）的免疫原性进行了研究。总体上本研究制备的各类疫苗均可诱导小鼠产生较强的体液免疫应答水平,产生较强的免疫应答,都能为铜绿假单胞菌感染提供良好的保护效果,且两者以初免-加强免疫的方式较其他疫苗组可诱导较好的Th1型免疫应答和Th2型免疫应答并有着不错的保护效果。本研究可以为铜绿假单胞菌感染治疗提供一定的参考。