近年来,由于核酸分子探针具有设计多样性、灵敏度高和强的定量分析能力等特点,发展灵敏度高和选择性好的核酸分子探针成为生物化学分析领域研究的热点之一。荧光各向异性,也被称作荧光偏振,是荧光物质的特有属性,因其快速、精确、灵敏的信号报告,使得荧光各向异性检测方法广泛应用于生物传感器的构建。荧光各向异性检测分析法作为一种比值检测方法,其值与荧光基团的振动弛豫时间密切相关,而振动弛豫时间与荧光基团所结合分子的分子量或分子体积呈正相关。荧光各向异性具有抗光漂白以及减小杂散光干扰等能力,其能够直接用于复杂生物体系的分析检测。随着科研的不断发展,荧光各向异性分析检测方法已被广泛应用于蛋白检测、药物筛选、食品分析、环境监测及生物化学研究等领域。然而依靠荧光分子质量或体积变化从而实现目标检测的传统荧光各向异性分析法在生物小分子检测分析方面存在一定困难。因为小分子自身分子量较小,与荧光分子结合之后质量变化小,此时荧光各向异性值变化就很微弱,该报告信号很难被检测到。为了解决该问题,科研工作者引入核酸适配体的应用,发展了一系列基于竞争取代机理、诱导构象变化机理以及质量放大策略的核酸荧光各向异性探针用于生物小分子检测分析。在本论文中,我们设计了一系列新颖的质量放大荧光各向异性信号的核酸探针,并成功应用于三磷酸腺苷(ATP)、腺苷、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)等生物小分子检测。具体内容如下:(1)利用杂交链反应以及链霉亲和素的双重荧光各向异性信号放大策略,我们提出了一种灵敏高、选择性好的荧光各向异性核酸探针,并将其应用于小分子ATP的检测分析,其检测下限为100 n M。与单独以蛋白质作为信号放大器或单独以杂交链反应作为放大策略进行对比,该实验的双重信号放大策略具有更高的灵敏度。此外,该设计探针能够用于多种复杂的生物样品中目标小分子ATP的定量检测,如在细胞培养基、人的血清以及人的尿液中,可以检测到0.5μM的ATP,初步证实该探针在实际生物样品中的潜在应用。(第2章)(2)结合链霉亲和素-生物素复合物和目标诱导酶切保护机理,我们发展了一种双重放大荧光偏振信号的策略,用于高灵敏地检测生物小分子荧光偏振核酸探针的构建。与单独以目标诱导酶切保护机理作为放大策略或单独以蛋白质作为信号放大器进行对比,该实验的双重信号放大策略具有更高的灵敏度。以腺苷为模型小分子,该策略检测下限达500 nM,其检测结果优于先前报道的荧光偏振核酸探针。此外,该实验方法具有普遍性,通过替换为不同的核酸适配体,可用于相应目标小分子检测。(第3章)(3)利用T4 DNA连接酶对ATP的高度依赖性和E.Coli DNA连接酶对NAD的高度依赖性,结合链霉亲和素-生物素复合物作为荧光各向异性质量放大器,我们发展了一种简单、快速、高灵敏度、高选择性的荧光各向异性核酸探针,并将其应用于小分子ATP和NAD的检测分析。当溶液中存在ATP或NAD时,DNA连接酶发生连接反应,接上质量放大部分,从而引起较大的质量变化,产生检测信号,其中ATP和NAD的检测下限分别为50 nM和10 nM,均低于现有的荧光各向异性分析法文献报道。利用DNA连接酶对生物小分子的高特异性依赖,该探针对ATP或NAD显示出非常高的选择性,能够成功地将目标分子与其类似物区分开。因此,该探针对于拓展荧光各向异性分析法在生物小分子检测中的应用范围具有重要的意义。(第4章)