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食管癌是人类最常见的原发性消化道恶性肿瘤，其在世界范围内的发病率位于恶性肿瘤的第8位。我国是世界上食管癌死亡率最高的国家之一，每年约15万人死于食管癌。在我国，由于大部分食管癌患者直到晚期症状都不明显，往往确诊时已属晚期，预后较差。近年来尽管普查、手术、化放疗、免疫、基因治疗或以上的综合应用，早期食管癌的预后有了明显的改善，但是晚期患者较差，五年生存率仍然很低。因此，寻找新的抗肿瘤药物，研究抗肿瘤药物作用的靶点及与食管癌发生发展相关的信号转导通路成为食管癌治疗研究的重点。多个信号转导通路参与食管癌的发生发展，其中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是最主要的一条信号通路。细胞外调节激酶（ERK）是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成员的重要分子。多种应激原及促分裂信号通过细胞内信号级联反应激活ERK，从而参与细胞的增殖、分化，凋亡及细胞间的恶性转化。P-ERK是ERK的活性形式，激活后转入胞核，通过磷酸化转录因子进而调控相关基因的表达。多个研究表明ERK活化水平的改变与包括食管癌在内的多种恶性肿瘤的发生发展有关[1～4]。因此该通路是目前研究的焦点，为临床治疗肿瘤提供新的靶点。蟾蜍灵（Bufalin）是从中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺及皮肤腺的干燥分泌物提取的主要活性成分之一，属于一种强心苷类物质，已被用来作为一种传统的中医治疗感染、麻醉及肿瘤。作为蟾蜍的有效抗癌成分之一，大量的体外实验表明能抑制多种肿瘤细胞的生长，临床上已经应用于治疗多种肿瘤，但是尚无治疗食管癌的报道。本实验探讨Bufalin对人食管癌细胞的作用，为临床应用于食管癌的治疗提供实验依据。为了研究Bufalin对食管癌有没有抗肿瘤作用及抗肿瘤机制是什么？是否与ERK信号通路有关？本实验利用食管癌细胞株TE13进行体外实验研究，通过检测食管癌细胞中ERK、p-ERK的水平变化，初步探讨了Bufalin作用于食管癌的机制及Bufalin与ERK抑制剂联合应用后对食管癌细胞的作用。目的：体外观察蟾蜍灵（Bufalin）对人食管癌细胞株TE13中ERK及其活化水平（p-ERK）的影响及Bufalin与ERK特异性抑制剂Uo126联合应用对人食管癌细胞的作用，探讨其可能的作用机制。方法：1.采用Western Blot方法检测含15%胎牛血清培养液刺激对食管癌细胞株TE13中ERK活化水平（p-ERK）的影响。2.采用免疫细胞化学法及Western Blot方法检测Bufalin作用后，人食管癌细胞株TE13中ERK及其活化水平（p-ERK）的变化。3.采用Western Blot方法检测Bufalin和ERK特异性抑制剂Uo126联合应用对食管癌细胞株TE13中p-ERK蛋白水平的影响。结果：1. Western Blot结果显示：含15%胎牛血清的培养液刺激食管癌细胞TE13，可以激活其p-ERK蛋白，并且随刺激时间的增加（0min,15min和30min），p-ERK蛋白相对表达量逐渐增强，当刺激达到30min时p-ERK表达最强，但在以后时间段内（60min,120min）p-ERK蛋白的表达明显减弱（0.582±0.005；0.641±0.005；0.680±0.003；0.567±0.003；0.579±0.004；P＜0.05），差异具有统计学意义。（Fig.1）2.免疫细胞化学法结果显示：ERK蛋白主要表达于食管癌细胞TE13胞浆中，为棕黄色，在高倍镜下观察呈颗粒状，结果显示Bufalin对食管癌细胞ERK蛋白表达无明显的促进或抑制作用（76.40%；76.80%；75.60%；77.60%；76.20%）,差异没有统计学意义（P=0.997＞0.05），（Fig.2）。而活化的ERK（P-ERK）主要表达于细胞核，或呈核-浆表达，为棕黄色颗粒，结果显示Bufalin对p-ERK蛋白的表达有明显的抑制作用，并且随着药物浓度的逐渐增加，阳性细胞数量逐渐减少，棕黄色颗粒逐渐变小，密度逐渐减低（79.60%；68.00%；57.00%；44.20%；11.00%；P＜0.05），呈剂量依赖性。（Fig.3）3. Western Blot结果显示：Bufalin对食管癌细胞ERK蛋白没有明显影响（0.703±0.020；0.706±0.020；0.711±0.018；0.716±0.007；0.708±0.005），差异不具有统计学意义（P＞0.05）。而Bufalin能显著下调p-ERK蛋白，并且随着药物浓度的增加，p-ERK蛋白水平呈下降趋势（0.686±0.046；0.608±0.029；0.523±0.032；0.348±0.017；0.273±0.022；P＜0.05），并且呈剂量依赖性关系。具有统计学差异。（Fig.4）4. Western Blot结果显示：Bufalin和ERK抑制剂Uo126联合应用组与单独应用Bufalin及Uo126组相比，p-ERK蛋白明显下调（0.713±0.010；0.662±0.002；0.610±0.007；0.403±0.010；P＜0.05），表明Bufalin可以明显增强Uo126对ERK的抑制作用，差异具有统计学意义。（Fig.5）结论：1. p-ERK蛋白与食管癌的发展相关。2. Bufalin可以通过ERK信号转导通路下调p-ERK，而ERK则不受影响，提示Bufalin可能是通过ERK活化这一过程而发挥作用，从而抑制食管癌细胞的生长。3. Bufalin联合Uo126能协同下调p-ERK,进而抑制食管癌细胞的生长，这样可以扩展强心苷类药物的应用范围，同时加强Uo126的疗效，具有潜在的临床应用价值。