柑橘溃疡病是影响我国柑橘产业的重要病害之一,为世界性的检疫性病害。该病害不仅损害柑橘产量和品质,且在防治过程中因大量使用化学药剂,对环境造成污染和破坏。因此,筛选抗溃疡病的品种是生产上解决溃疡病问题的关键。本研究以6个柑橘种质为材料,利用eGFP标记的柑橘溃疡病病株,通过喷雾高浓度和注射接种不同浓度的溃疡病菌,对其进行抗性评价。并采用不同接种方式对枸橼C-05和‘冰糖橙’进行接种,从细胞水平观察溃疡病菌的侵染过程、病原菌在寄主内的定殖情况及病症的发展过程,同时对溃疡病菌入侵柑橘时与寄主防卫反应以及相关的基因的表达进行了分析。通过转录组学挖掘‘冰糖橙’在响应溃疡病侵染过程中的关键基因,解析其调控机理。主要研究结果如下:1、利用eGFP标记的溃疡病菌株喷雾接种6个柑橘属的不同种质,结果表明在接种后前3天溃疡病菌在抗感品种叶片上的分布和菌量没有差异。第6天枸橼C-05叶表的菌量开始减少,而感病品种增加。接种后的第10天感病品种出现明显的凸起病症。通过切片观察,发现喷雾后的前3天溃疡病菌主要聚集在叶片表皮。注射后第6天,溃疡病菌入侵到感病‘冰糖橙’叶片的叶肉组织;到第9天开始破坏叶片结构;接种后14天,病原菌已破坏整个叶肉组织,形成明显火山口凸起。而枸橼C-05喷雾后整个过程叶片组织未受到任何破坏,也未形成任何症状。2、使用不同浓度的溃疡病菌注射接种6个柑橘属不同的种质,注射后第8天,除枸橼C-05外,其他品种在106cfu/ml注射区域都出现了水渍状的溃疡病症。注射后20天,除枸橼C-05外,其他品种在103cfu/ml注射区域出现了凸起的溃疡病症,且浓度越高症状越严重。接种后27天,枸橼C-05始终未出现凸起的黄色晕圈等典型的溃疡病症状。用浓度为104cfu/ml的溃疡病菌注射后统计溃疡病菌在叶片内的繁殖和病症形成情况,发现注射后的前4天溃疡病菌在6个柑橘种质中的生长没有差异,4天后枸橼C-05叶片内的溃疡病菌生长缓慢,而其他品种叶片内的菌量要远高于枸橼C-05。切片观察到,注射接种后,溃疡病菌首先在‘冰糖橙’上下表皮开始聚集,随后开始向叶肉组织扩展,第4天病原菌开始破坏叶肉组织。第6天形成凸起。接种后16天,叶肉组织被病原菌严重破坏。病原菌在枸橼C-05叶肉组织内生长缓慢,对叶片的正常结构破坏较小。3、对抗感柑橘种质受溃疡病菌侵染后产生的防御反应进行研究。结果表明:注射接种溃疡病后,枸橼C-05产生了大量胼胝质来抵御溃疡病菌的入侵,同时检测到了ROS的累积和HR反应。在溃疡病菌入侵的过程中还引起了枸橼C-05内防御基因的表达。4、对‘冰糖橙’接种溃疡病菌后的第2d、6d、8d和12天,以及接种水稻白叶枯（Xoo）为对照的第2天和8天样品,进行转录组测序分析。GO注释发现差异表达基因富集数目最多的是细胞组分。KEGG分析发现差异基因主要在植物-病原菌相互作用、植物激素信号转导、淀粉与蔗糖代谢、氨基糖与核苷酸代谢、苯丙基类生物合成、碳代谢中富集。通过对注射Xcc和Xoo后8天和12天的基因表达水平分析,发现Xcc诱导了大量细胞壁相关基因的上调表达,如纤维素内切酶,糖基水解酶,果胶裂解酶,果胶脂酶等细胞壁调节酶以及扩张蛋白等细胞壁蛋白基因。5、定量PCR验证果胶裂解酶（Pectate lyase,PL）、扩展蛋白（Expansin,EXP）和纤维素酶（Cellulase,CEL）这3个基因在响应溃疡病侵染过程中的表达情况,发现在感病品种‘冰糖橙’溃疡病症出现时,这3个基因开始大量表达;而在抗病品种枸橼C-05中未出现类似情况。克隆抗感品种中PL、EXP和CEL基因组序列,发现‘冰糖橙’和枸橼C-05的PL基因（CsPL,CmPL）全长分别为1675 bp和1657 bp,含4个外显子和3个内含子,均编码404个氨基酸,同源性为99.3%。EXP基因（Cs EXP,Cm EXP）全长均为1159 bp,含4个外显子和3个内含子,均编码274个氨基酸,同源性为99.3%。CEL基因（Cs CEL,Cm CEL）全长分别为2278 bp和2249 bp,含7个外显子和6个内含子,均编码506个氨基酸,同源性为99.4%。6、克隆‘冰糖橙’和枸橼C-05的PL基因启动子（pCsPL,p CmPL）,序列大小分别为1807和1812 bp,同源性为94.5%。两者共有脱落酸响应、光响应相关以及厌氧感应相关的顺式元件等。水杨酸响应元件为pCsPL特有,而茉莉酸甲酯响应元件为p CmPL特有。EXP基因启动子（pCs EXP,p Cm EXP）序列大小分别为2006和2032 bp,同源性为93.9%。其中脱落酸响应元件、茉莉酸甲酯诱导元件、赤霉素诱导元件、激素诱导元件、茉莉酸甲酯诱导元件、细胞周期调节元件、玉米蛋白代谢调节元件、MYBHv1结合位点等为两者共有。此外,pCs EXP还包含水杨酸诱导元件,p Cm EXP中特异存在α-淀粉酶促进元件和胚乳负调控元件。CEL基因启动子（pCs CEL,p Cm CEL）序列大小分别为1606和1603 bp,同源性为97.9%。两者都含有脱落酸响应元件、茉莉酸甲酯诱导元件、水杨酸诱导元件;同时还存在一个转录因子MYBHv1结合位点,以及厌氧诱导元件、分生组织表达元件、胚乳表达元件、玉米蛋白代谢调节元件等。7、构建了‘冰糖橙’Cs EXP和Cs CEL基因的超表达载体35S::Cs EXP::e YFP和35S::Cs CEL::e YFP。通过亚细胞定位分析,表明EXP和CEL蛋白定位于细胞膜上。在感病种质‘冰糖橙’中进行瞬时超表达,结果显示,Cs EXP及Cs CEL瞬时超表达后叶片中溃疡病的病斑数要高于空载体对照。