【摘 要】
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目的:构建含解离素（Disintegrin,DI）基因序列的pET21a（+）表达载体,转化至Origami B（DE3）表达系统,通过对诱导条件的优化,高效表达重组解离素融合蛋白;通过镍柱亲和层析获得纯化的重组解离素（r-DI）,经验证后,为后期的生物活性测定、构效关系研究和体内抗肿瘤活性应用奠定实验基础。方法:1.pET21a（+）-DI表达载体的构建（1）cDNA序列的合成:对已知的解离素氨
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目的:构建含解离素（Disintegrin,DI）基因序列的pET21a（+）表达载体,转化至Origami B（DE3）表达系统,通过对诱导条件的优化,高效表达重组解离素融合蛋白;通过镍柱亲和层析获得纯化的重组解离素（r-DI）,经验证后,为后期的生物活性测定、构效关系研究和体内抗肿瘤活性应用奠定实验基础。方法:1.pET21a（+）-DI表达载体的构建（1）cDNA序列的合成:对已知的解离素氨基酸序列进行分析,优化并合成相应两端加入Nde I及Xho I酶切位点的cDNA序列。（2）表达载体的构建:Nde I-Xho I双酶切合成的cDNA获得DI目的基因,克隆至相同双酶切得到的线性质粒载体pET21a（+）,并进行克隆菌E.coli T1的转化以便对重组质粒的保存。2.重组解离素的表达及纯化（1）表达载体的转化:对阳性单克隆菌测序鉴定后,提取质粒载体,Ca Cl2法将重组质粒转化至表达菌Origami B（DE3）,挑取单克隆双酶切鉴定,并测序。（2）重组解离素表达条件的探索:探索2YT以及自诱导（ZYD）培养基培养条件下对于重组解离素表达的影响,确定最优表达条件。（3）重组解离素的纯化:将破碎细菌上清液经亲和镍柱处理,得到纯化的重组解离素。3.重组解离素纯度及免疫原性鉴定以Tricine-PAGE凝胶电泳对的分子量以及纯度进行分析,在免疫印迹试验中,通过抗蝮蛇毒血清和His标签抗体在免疫原性方面确定r-DI的正确表达。4.重组解离素的生物活性鉴定（1）抗血小板聚集活性测定:检测r-DI的抗血小板聚集活性。（2）抑制肿瘤细胞生长、黏附、迁移、侵袭及抑制小管生成能力测定:MTT法检测r-DI杀伤肿瘤细胞以及抗细胞黏附活性,小管生成实验检测其抑制细胞血管生成能力,划痕法检测其抗细胞迁移活性,细胞侵袭实验检测其抗肿瘤细胞侵袭能力。（3）表面等离子体共振（SPR）实验:分析r-DI与配体蛋白整合素αⅡbβ3的相互作用,测定相关的动力学常数（Ka,Kd）及亲和力常数（KD）。结果:1.解离素cDNA的合成:合成的cDNA为219 bp大小,Nde I和Xho I双酶切pET21a（+）质粒载体以及cDNA片段,纯化后进行定向克隆连接,得到pET21a（+）-DI表达载体,表达出来的蛋白C-末端含有His标签序列。2.表达载体的构建:经菌落PCR,酶切及测序鉴定,表达载体成功转化入克隆菌以及表达菌。3.重组解离素的最佳表达条件:通过对2YT以及ZYD培养基不同条件的优化,确定在ZYD培养基中,诱导温度23℃,诱导时间20 h为重组解离素的最佳表达条件。4.具有蝮蛇毒抗原性的重组解离素的获得:经亲和镍柱层析纯化,成功从破碎菌液上清分离重组解离素,产量为10 mg/L,以Tricine-SDS PAGE凝胶电泳鉴定得其分子量大概为8.7 k Da,且纯度大于95%;Western Blot结果发现以抗His标签抗体和抗蝮蛇毒血清作为一抗,分别孵育PVDF膜,均有条带显出,证明r-DI成功表达。5.重组解离素抗血小板聚集活性测定:r-DI对ADP诱导的血小板聚集具有抑制作用,不同浓度（1.4,2.9,5.9μM）下,血小板聚集抑制率可达28%,53%,91%。6.重组解离素对B16F19生长和侵袭能力的影响:r-DI能明显抑制B16F10小鼠黑色素瘤细胞的增殖,其IC50为13.8μg/m L（1.59μM/L）,且呈剂量依赖性方式抑制细胞对于基质胶的粘附作用,细胞的小管生成,迁移能力和侵袭效应,不同浓度（0.12,0.58,1.15μM）的r-DI对细胞黏附的抑制率可达20.3%,39.7%,50.2%,对于细胞侵袭的抑制率可达31.7%,49.3%,71.1%。7.重组解离素与整合素αⅡbβ3亲和力的测定:r-DI与整合素蛋白αⅡbβ3的结合常数Ka为4.23x10-3mol/L,解离常数Kd为5.91x10-3mol/L,亲和力为1.40x10-6mol/L。结论:1.应用分子克隆的方法成功构建原核表达载体DI-pET21a（+）,转化至表达菌Origami B（DE3）,并成功表达出重组解离素融合蛋白,探索出最佳诱导条件,且具有较高的产量。2.在体外,r-DI具有抑制由ADP诱导的血小板聚集、肿瘤细胞的粘附、血管生成、迁移和侵袭等活性。3.r-DI与整合素蛋白αⅡbβ3具有较好的亲和力,能够发生特异性地结合,发挥竞争性阻断该受体的作用。
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