【研究背景】胃癌(gastric cancer,GC)是导致癌症相关死亡的主要原因之一,并且以亚洲最为多见。随着学者对胃癌研究的深入,其发病率正在逐渐下降,根治性手术治疗是唯一有效的胃癌治疗方法,尽管新辅助化疗和围手术期化疗改善了患者的预后,但效果仍然不理想。主要原因可能是胃癌倾向于在早期发生转移,而患者确诊时大多为进展期胃癌,腹膜播散以及局部和远处转移常常已经出现,并显著降低了手术的效率,错过了早期根治的黄金时间。因此对胃癌发生及转移关键分子的研究刻不容缓,以提高早期确诊率,并寄希望从中找出胃癌治疗的靶点,研发新型治疗手段,从而改善患者预后。Mortalin,又被称为GRP75和HSPA9,是热休克蛋白家族(HSPs)中的一员,主要定位于线粒体,是一个高度保守的热休克分子伴侣蛋白,涉及包括应激反应,细胞增殖和凋亡等多种功能,并且与肿瘤的发生密切相关。已有多项报道在多种肿瘤组织中发现了异常升高的mortalin。已知的研究中,mortalin可作用于多个下游因子,包括p53,FGF-1,IL-1受体1,GRP94,VDAC,NADH脱氢酶,MPD和Tim23等因子,并参与许多控制细胞增殖的分子途径。Mortalin蛋白被证实在多种癌细胞中,如肝癌、卵巢癌、乳腺癌中均有高表达,并参与了癌细胞的生长及增殖。近期的研究也在胃癌中年发现了与预后明显相关的mortalin高表达。微小RNA(Micro RNAs)是一组通过结合靶目标的3’-UTR端在翻译后水平负性调节靶基因表达的小型非编码RNA。我们之前的miRNA微阵列分析,发现miR-491在癌旁组织中表达较高,而在胃癌组织中是低表达的。随后我们通过与miRNA的在线数据库Target Scan的联合比对,我们发现miR-491可能拥有结合并调控mortalin的能力。先前已有多项研究表明,miR-491在多种癌症中具有抑癌作用。因此,本文的研究目的是探究在胃癌细胞中miR-491与mortalin蛋白的作用关系,并且探索mortalin蛋白在胃癌细胞中的作用机制,以期待发现早期诊断的胃癌标志物,改善目前胃癌诊断及治疗的格局。【研究方法】以IARC网站确认后的野生型p53细胞株BGC823及突变型p53细胞株SGC7901为实验基本模型,首先测定mortalin及miR-491的含量并通过细胞沉默或转染观察mortalin或miR-491对肿瘤增殖能力的影响;通过使用靶基因预测软件(Target Scan 6.0)分析和序列比对,我们发现miR-491可以与mortalin亚基的3’-UTR区结合位点相结合,随后通过荧光素酶报告、细胞转染、PCR、免疫印迹等方法验证miR-491与mortalin的结合效应,观察miR-491的变化对mortalin表达及细胞活力的影响;随后通过对mortalin下游因子p53表达量的检测,阐明mortalin依赖野生型p53的作用机制;通过检测KEGG-Pathway筛选出代谢通路因子、细胞活力及葡萄糖摄取量的测定,阐明mortalin在p53突变后的非p53依赖性途径;最后通过人群数据分析,比较不同组患者的生存曲线得出miR-491与mortalin在胃癌中相互作用并影响肿瘤特性及患者预后。【研究结果】1.在胃癌细胞BGC823/SGC7901中,miR-491的表达量降低,并且在过表达胃癌细胞株中的miR-491后,呈现出了对胃癌细胞株生长的抑制作用。同时在胃癌细胞BGC823/SGC7901中,存在高表达的mortalin蛋白,而沉默mortalin后的,胃癌细胞出现了不同程度的增殖能力的下降。2.通过靶基因预测软件(Target Scan 6.0)分析和序列比对,我们发现mortalin亚基的3’-UTR区存在miR-491的结合位点,同时,进一步在胃癌细胞中转染miR-491-mimic发现Mortalin亚基的3’-UTR荧光素酶报告基因活性及m RNA表达水平均显著下降。3.在胃癌细胞BGC823/SGC7901中,miR-491可能通过与mortalin蛋白相结合,抑制mortalin的促肿瘤生长功能,进而影响肿瘤细胞的生长及增殖。4.在野生型p53的BGC823细胞株中,单独沉默mortalin蛋白后,胃癌细胞中的p53含量明显升高;单纯的高表达miR-491,也会出现细胞中p53含量的升高;而在高表达miR-491的同时,高表达mortalin,我们会发现在原本过表达miR-491而使得细胞内p53含量升高的基础上,过表达mortalin则会使p53的含量明显下降,产生逆转效应。5.我们通过string数据库,以mortalin蛋白为核心,寻找并挑选出了其与60种蛋白相互作用的网络。再通过KEGG pathway数据库,对mortalin蛋白的信号通路进行分析,结果显示代谢途径为其发挥作用重要的通路之一。6.在突变型p53的SGC7901细胞株中,通过简单的葡萄糖摄取试验发现,沉默mortalin以及高表达miR-491的处理组,葡萄糖摄取能力均较低。而在同时有高表达miR-491和mortalin的实验组中,尽管与对照组相比仍然较低,但与单纯过表达miR-491相比,癌细胞对葡萄糖的摄取能力有所提高。Western blot显示在SCGC7901细胞中,单纯沉默mortalin或高表达miR-491,代谢因子p-AKT、HIF-1α以及c-myc均有不同程度的表达降低。而在过表达miR-491的同时,过表达mortalin后,p-AKT、HIF-1α和c-myc等因子的表达量有所“回升”。7.细胞活力测定提示,在野生型p53的BG823细胞及突变型p53的SGC7901细胞中,过表达miR-491和沉默mortalin,均下调了胃癌细胞的活力,而在既高表达miR-491,又高表达mortalin的细胞中,其细胞活力对比空白对照组虽有所下降,但相对于单纯过表达miR-491或沉默mortalin的实验组,其活力仍然处于较高的状态。8.对116例胃癌人群的临床数据分析提示,癌细胞中mortalin的染色评分明显高于癌旁组织,而miR-491在癌旁组织中的表达明显高于胃癌组织。mortalin的表达量与肿瘤直径的大小呈现出正相关。同时过表达的mortalin及低表达的miR-491的患者,其生存预后明显较差。【实验结论】1.mortalin在胃癌组织中的表达量较癌旁组织明显上升,而miR-491在胃癌中的表达量明显较癌旁组织降低。2.miR-491与mortalin m RNA的3’-UTR区相结合并抑制mortalin的表达,进而影响肿瘤细胞的增殖。3.mortalin在胃癌中通过p53依赖性及非p53依赖性两条途径共同发挥作用,促进肿瘤的生长增殖。4.胃癌组织中过表达mortalin的同时伴随低表达的miR-491的患者,具有较差的生存预后。本研究对胃癌中mortalin的促肿瘤增殖作用及miR-491的抑制作用提供了实验依据,并通过p53依赖途径及代谢途径分别阐明mortalin了在野生型p53胃癌细胞中及突变型p53胃癌细胞中的作用机制,并为胃癌今后诊断及治疗的研究提供了新思路。