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[背景]轮状病毒（Rotavirus,RV）是造成婴幼儿腹泻死亡的主要病原体,其传播途径为粪-口途径,主要临床表现为发热、呕吐、腹泻、脱水、电解质紊乱等。尽管目前已有可用的RV相关疫苗,但每年由RV引起的死亡病例仍达数十万例,给社会带来了沉重的疾病负担。根据VP6抗原性的不同,将RV分成A～J 10个组,其中A组轮状病毒（GroupA Rotavirus,RVA）是引起婴幼儿腹泻的主要病原,90%婴幼儿RV性腹泻由RVA引起。根据VP7和VP4抗原性的不同,又可以将RV进一步分为G基因型和P基因型,目前已经发现了 36个G基因型和51个P基因型。RVA导致的腹泻病常年流行,无明显的地域特征,G1～G4、G9、P[8]和P[4]这些基因型共同循环组成了世界上常见的流行型别。但世界各国流行的G、P基因型及其组合型别在空间和时间上大多表现出复杂多变的特征。通过分析研究RV的分子流行病学特征,有助于全面了解某段时期RV在研究区域人群中的流行情况,从而对采取针对性防控措施和有效减少相关疾病负担具有重要的公共卫生学意义。目前RVA人群监测资料主要来源于住院和门诊腹泻患儿,但人群中还存在着大量轻型、隐性感染及恢复期带毒者等不就医的感染者。因此,来源于临床标本的病原信息主要反映了人群中流行的优势型别,对其他非主流型别甚至潜在的优势型别通常不能提供全面信息,容易出现监测信息偏倚甚至监测空白,从而低估一个地区RVA的真实流行状况。环境监测作为一种敏感的病毒监测手段,已经较好地运用于肠道病毒（Enterovirus EV）分子流行病学研究中。鉴于RVA的感染和传播主要通过粪-口途径,因此来自生活污水的RVA监测信息会更加全面,更能反映全人群中RVA的流行特征,从而弥补临床监测资料的不足,特别是在一些RVA监测体系比较薄弱的地区,RVA的环境监测显得更加重要。新近兴起的下一代测序技术（Next generation sequencing,NGS）在探索标本中复杂的病原体物种分布方面更具优势,将其应用于环境污水中的RVA监测,能为进一步阐明RVA在人群中的流行多样性和遗传变异规律提供更全面的数据。[目的]本研究通过对济南地区2018年部分月份和2019年全年生活污水中RVA的VP7和VP4基因扩增,并对扩增子分别通过TA克隆测序和NGS技术两种方案进行比较分析,从而实现如下研究目的:1.建立基于扩增子NGS方法,检测污水中的RVA,评估其与传统TA克隆测序方法相比的优势。2.掌握济南生活污水中RVA型别分布及其动态变化特征。3.探索济南RVA流行型别的系统发生学特征。[方法]1.污水的采集和浓缩:选取生活污水监测点,在2019年1～12月份使用定时定量采集法每月采集生活污水样本,使用阴离子膜吸附洗脱法对污水样本进行浓缩和富集。2.核酸提取、RT-PCR和测序:提取2019年12个月份和2018年9和11月份水样中的核酸,进行RVAG和P基因扩增。将2018年2个月份水样的RT-PCR阳性扩增产物分别采用2种不同方法进行测序,方法1是采用TA克隆和Sanger测序,方法2是对阳性扩增子直接进行NGS测序。2019年的所有月份标本使用后者进行检测。3.序列分析:使用BioEdit7.0.9.1软件对获得的2018年2个月份RVA的Sanger测序结果进行序列整理,NGS获得的结果运用CLC Genomics Workbench 12.0软件进行分析,将得到的所有序列进行BLAST比对定型。对2018年两个月份污水样本使用2种方法检测分析,进行方法学评价;对2019年样本中获得的RVA序列运用BioEdit 7.0.9.1软件进行核苷酸和氨基酸同源性分析,用Mega 7.0软件进行系统发生学分析。[结果]1.不同方法检出RVA基因型的效果比较2018年9月和11月水样中,两种方法的RVAG和P基因型检测均为阳性。方法1在2个月份只获得了 G9和P[8]两种基因型序列。方法2在9月份的水样中检出5种G基因型,分别为G2、G3、G9、G14和G27;在11月份的水样中检出5种G基因型,分别为G1、G2、G3、G9和G14;在两个月份中均检出2种P基因型,P[4]和P[8]。G9和P[8]是方法2中检出比例最高的基因型,两种方法的RVA基因型检出比例分别为25%和87.5%2.2019年RVA基因型检出情况、型别分布及时间动态变化2019年12个月份共采集12份污水标本,经过RVA VP7和VP4 RT-PCR检测,其中有11份样本检出RVAG基因型,检出率为91.7%（11/12）;12份样本均检出RVAP基因型,检出率100%（12/12）。本研究在济南市的污水中共发现了 10种RVAG基因型,分别为G1、G2、G3、G4、G6、G9、G11、G12、G27和G32,其中G9基因型的读长占比最高,其次是G3基因型,占比分别是75.60%和19.24%。共检测到14种P基因型,分别为P[3]、P[4]、P[6]、P[8]、P[9]、P[14]、P[17]、P[24]、P[30]、P[31]、P[35]、P[36]、P[38]和P[45],其中P[8]的检出比例最高,占比86.70%。G9型是2019年上半年各个月份的优势型别。G3型的检出比例从7月开始逐月增高,在10月和11月成为当月的优势型别。P[8]一直是检出率最高的P基因型,但P[3]和P[4]检出率都出现过短暂的升高。3.RVA同源性及系统发生学分析2019年的样本经过NGS测序、组装和分析,获得的序列较多,并且长短大多不一致,本研究挑选长度接近PCR目的片段全长的序列进行同源性和系统发生学分析,共获得7种G基因型和8种P基因型序列。7种G基因型序列分别为G1（1条）、G2（5条）、G3（22条）、G4（1条）、G6（11条）、G9（11条）和G12（2条）。其中G9型内同源性较高,系统进化树显示其可分成2个进化分支。G3的型内同源性较低,系统进化树显示其可分成4个进化分支。G2和G12型内同源性较高,系统进化树显示其都处于同一进化分支中。G6型内同源性较低,系统进化树显示其可分成两个进化分支。8种P基因型序列分别为P[3]（13条）、P[6]（3条）、P[8]（11条）、P[9]（2条）、P[14]（1条）、P[17]（2条）、P[30]（1 条）和P[31]（5条）。其中P[8]的型内同源性较高,系统进化树显示其可分成2个进化分支。P[17]的型内同源性较低。其余多于1条序列的型别,其型内同源性均较高,系统进化树显示P[6]可分成两个进化分支。[结论]1.生活污水中有丰富的RVA遗传信息,污水监测是一种掌握人群消化道病毒区域性流行的有效手段。2.本研究监测地区生活污水中的RVA检出率很高,提示RVA在监测地区人群中呈持续性流行。3.监测地区RVA具有丰富的型别多样性,G9和P[8]基因型呈现明显的优势流行态势。4.系统发生学显示监测地区的RVAG9和P[8]基因型存在多个传播链。5.与传统的扩增子TA克隆后Sanger测序方法相比,使用NGS方法可以获得更加丰富的RVA信息。