研究背景儿童扩张性心肌病（Dilated Cardiomyopathy,DCM）是一种以左心室或双心室扩张,及左室收缩功能不全为主要表现的心肌病,通常可导致进行性充血性心力衰竭、室性心律失常,甚至心源性猝死等严重后果。它是目前导致儿童、青少年死亡和心源性致残的主要原因,也是目前全世界儿童进行心脏移植的主要适应证。人们认为在儿童中DCM的发生机制是遗传易感性和环境损伤共同作用导致的。然而,该病的具体发生和其致病机制仍不明确。与其他成人DCM相比,儿童的DCM似乎具有更广泛的病因,包括特发性、基因突变、心肌炎、神经肌肉紊乱和先天代谢系统的障碍。最近,基因修饰和表观遗传调控已成为研究儿童DCM发病机制的重要来源。环状RNA（circle RNA,circRNAs）是一类内源性RNA,通过真核生物的前体mRNA进行逆剪接而产生。在结构上,circRNAs形成独特的共价环,没有5’帽或3’聚腺苷化尾,比普通线性RNA分子表现出更大的稳定性和序列保守性。此外,circRNAs通常具有细胞和组织特异性。circRNAs参与调控过程已得到公认,包括转录调制、剪接干扰、microRNA（miRNA）隔离和翻译。近些年来,越来越多的研究结果表明,一些circRNAs可能作为一种“miRNA海绵”,自然分离并竞争性地抑制miRNA活性,这提示circRNAs极大可能在转录后的调控功能中起重要作用。也有报道称circRNAs通过与RNA结合蛋白和翻译调节因子相互作用或直接与mRNA结合来调控基因表达。此外,circRNAs在体内和体外都可以被翻译。最近关于circRNAs的研究提高了我们对它们在心血管疾病中发挥作用的机制的认识。然而,需要对circRNAs在DCM发病机制中的作用进行深入研究,以开发早期诊断技术,并提出新的治疗靶点。研究目的本实验旨在研究DCM患儿与正常儿童外周血白细胞中circRNAs的差异表达,根据circRNAs-miRNA-mRNA网络的表达情况,探讨其可能的调控机制,为研究DCM的发病奠定基础。同时,验证差异表达的circRNAs,为寻找扩张型心肌病治疗的生物标志物提供重要理论依据。研究方法本实验收集2019年2月1日至2020年6月31日期间,在山东省立医院小儿心脏科病房确诊的25例DCM患儿的外周血作为DCM组,在山东省立医院儿童保健及发育门诊查体的25例健康儿童的外周血作为对照组。选择其中3例DCM组和3例对照组进行基因芯片技术分析,发现差异表达的circRNAs和mRNAs,并应用基因本体（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）构建的circRNA-miRNA-mRNA相互作用网络对差异表达circRNAs的生物学功能进行评估,以预测差异表达基因和DCM相关途径的潜在功能。最后,进一步通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）法验证芯片数据的准确性,并在25例DCM患儿和25例健康儿童中验证差异表达的circRNAs,并通过Sanger测序验证产物。研究结果1.共有25例DCM患儿及25例健康儿童符合入组标准,两组在性别及年龄方面是基本相匹配的。将两组间超声心动图中左室舒张末期内径Z分数、左室射血分数,心肌酶中的脑钠肽前体、超敏肌钙蛋白T,C-反应蛋白,心胸比等的数据进行统计分析,发现P值<0.001,具有显著的统计学差异。另外,DCM患儿中存在病毒感染的有15例（60%）,存在心电图异常的有21例（84%）,存在基因异常的有16例（64%）,这些在对照组儿童中均没有表现。2.通过DCM患儿与健康儿童外周血白细胞芯片数据的比较,以差异倍数≥2或≤0.5以及P<0.05作为有差异表达的circRNAs的截断标准,发现共有1156个circRNAs在DCM中差异表达,其中表达下调的circRNAs（899个）明显多于表达上调的circRNAs（257个）。另外,发现了 641个差异表达的mRNAs,其中表达上调的mRNAs（482个）明显多于表达下调的mRNAs（159个）。通过对差异表达的circRNAs的初步分析,发现其主要来源于2号染色体、1号染色体和5号染色体。此外,这些circRNAs的长度通常小于2000个核苷酸,主要集中于小于500个核苷酸。3.在GO富集分析中,BP中富集最多的3个为“损伤反应”、“炎症反应”和“细胞因子分泌”;CC中排名前三的是“内膜系统”、“褶皱膜”和“核内体膜”;在MF中最丰富的是“酶结合”、“SMAD结合”和“过氧化物酶活性”。在KEGG通路分析中显示了,差异表达circRNAs中相关的KEGG通路最多的前30位,其中通路主要富集于“Toll样受体信号通路”、“FcgR介导的吞噬作用”等,这些通路可能与DCM的生物发生机制相关。4.我们成功设计并合成出4个circRNAs的引物序列,在进行qRT-PCR时稳定扩增,并且产物通过Sanger测序证实为目标产物。5.经过qRT-PCR实验证,相比较于对照组,DCM组中hsacirc0067735下调（0.45倍,P<0.001）,hsacirc0070186上调（2.82倍,P<0.001）,hsacirc0069972下调（0.50倍,P<0.05）,这三者表达趋势与芯片数据一致,均具有统计学意义。hsacirc0005495下调了 0.69倍（P<0.05）,该circRNAs表达趋势与芯片数据结果相反。对这些circRNAs进行的功能分析表明,它们与肥厚、重塑、纤维化和自身免疫相关。6.利用软件预测了前10个上调和下调倍数最高的差异表达circRNAs的五个miRNAs结合位点,预测其可能吸附的miRNAs。另外,还完成了 hsacirc0067735、hsacirc0069972、hsacirc0070186 三种 circRNAs 的 circRNAs-miRNA-mRNA共表达网络。研究结论1.通过基因芯片分析,DCM患儿的外周血白细胞中circRNAs和mRNAs的表达存在显著差异。2.通过GO和KEGG分析等方式构建的circRNA-miRNA-mRNA相互作用网络对差异表达circRNAs的生物学功能进行评估,推测差异表达的circRNAs有可能影响损伤反应以及Toll样受体信号通路,通过ceRNA机制参与转录水平的调控,影响蛋白表达以及miRNA的吸附作用,从而参与DCM的发生、发展的作用机制。3.通过qRT-PCR实验验证了 4个circRNAs中有3个趋势与芯片结果相一致,证实了芯片结果具有一定的可靠性和可重复性。其中,hsacirc0067735、hsacirc0069972和hsacirc0070186的差异表达均具有统计学意义,具有成为非侵入性诊断儿童DCM的生物标志物的潜力。