【摘 要】
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EPHA2基因位于人类染色体1p36,其编码的EPHA2蛋白属酪氨酸蛋白激酶受体,在人类晶体上皮细胞和纤维细胞有大量表达,通过与其配体ephrin的结合指导细胞间的相互作用,来维持晶体细胞正常形状和高度有序排列,从而终生维持晶体的透明度.前期实验证实,该基因16内含子剪切突变(c.2826-9G＞A),可导致先天性全白内障的发生.为了研究EPHA2基因剪切突变对EPH-ephrin信号通路的影响,
【机 构】
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中国医科大学医学基因组学教研室 教育部医学细胞生物学重点实验室,沈阳110001
【出 处】
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中国遗传学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会
论文部分内容阅读
EPHA2基因位于人类染色体1p36,其编码的EPHA2蛋白属酪氨酸蛋白激酶受体,在人类晶体上皮细胞和纤维细胞有大量表达,通过与其配体ephrin的结合指导细胞间的相互作用,来维持晶体细胞正常形状和高度有序排列,从而终生维持晶体的透明度.前期实验证实,该基因16内含子剪切突变(c.2826-9G＞A),可导致先天性全白内障的发生.为了研究EPHA2基因剪切突变对EPH-ephrin信号通路的影响,构建了pcDNA3.1-IRES-EPHA2-WT/INS真核表达载体,以观察突变EPHA2蛋白表达水平变化,并初步探讨该剪切突变导致先天性全白内障的分子致病机制.目的:在pcDNA3.l真核表达载体多克隆位点中插入IRES序列,并在IRES序列前后分别插入突变及野生型EPHA2基因cDNA全长,在293T细胞系中观察突变蛋白表达以及该剪切突变对EPH-ephrin信号通路的影响.方法:以pcDNA3-IRESneo为模板PCR扩增IRES序列,设计上下游引物分别引入BamHI,CIaI及SmaI,EcoRI酶切位点,利用BamHI/EcoRI双酶切PCR产物及pcDNA3.l(+)空载体,将IRES序列定向插入pcDNA3.1(+)载体MCS中,命名为pcDNA3.1-IRES.SmaI/XhoI双酶切pcDNA3.1-IRES,将己克隆的野生型EPHA2基因cDNA全长插入至IRES序列后,命名为pcDNA3.I-IRES-EPHA2-WT.以NheIlClaI双酶切该载体,在IRES序列前插入突变型cDNA全长,并酶切电泳和DNA测序验证.结果:酶切、PCR和DNA测序鉴定均证实插入片段的正确性,免疫印迹检测该载体在真核细胞中能够表达.结论:成功构建pcDNA3.1-IRES-EPHA2-WT/INS真核表达载体,为进一步研究EPHA2基因剪切突变对EPH-ephrin下游信号系统的影响及导致先天性全白内障的分子致病机制奠定了基础。
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