【摘 要】
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先天性白内障是一种常见的可导致儿童时期视力障碍或全盲的疾病之一.我实验室前期实验证实,EPHA2基因内含子点突变(c.2826-9G＞A)与常染色体显性全白内障的发病相关.该突变形成一异常剪切位点,导致内含子16中的7bp碱基被错误包含在异常转录本中,继而导致大范围移码突变和终止密码子延迟出现.EPHA2蛋白属酪氨酸蛋白激酶受体,在人类晶体上皮细胞和晶体纤维细胞大量表达,通过与其配体ephrin结
【机 构】
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中国医科大学医学基因组学教研室,沈阳 110001 中国医科大学实验动物部,沈阳 110001
【出 处】
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中华医学会2012年医学遗传学年会暨全国第十一次医学遗传学学术会议
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先天性白内障是一种常见的可导致儿童时期视力障碍或全盲的疾病之一.我实验室前期实验证实,EPHA2基因内含子点突变(c.2826-9G＞A)与常染色体显性全白内障的发病相关.该突变形成一异常剪切位点,导致内含子16中的7bp碱基被错误包含在异常转录本中,继而导致大范围移码突变和终止密码子延迟出现.EPHA2蛋白属酪氨酸蛋白激酶受体,在人类晶体上皮细胞和晶体纤维细胞大量表达,通过与其配体ephrin结合指导晶体细胞间的有序排列,以维持晶体透明度.目的 通过构建含有突变EPHA2基因cDNA全长的转基因载体,建立C57BL/6J小鼠先天性白内障模型进行表型分析.方法 转基因载体采用受精卵雄原核注射方式整合于转基因小鼠基因组DNA中,小鼠生后3周进行PCR转基因阳性鉴定.鉴定引物设计选取转基因载体序列中特异片段.所得阳性founder小鼠与野生B6小鼠杂交传代建系.取子二代阳性小鼠,采用裂隙灯照相方法明确先天性白内障诊断.对确诊小鼠进行晶体蛋白western blot检测,观察EPHA2突变蛋白表达水平.制作转基因阳性小鼠及同组阴性对照小鼠眼球组织石蜡切片,进行HE染色及免疫组化染色,观察小鼠晶体大体形态的改变及晶体上皮细胞与晶体纤维细胞形态的改变.结果 首建系小鼠总数为75只,鉴定阳性founder小鼠3只,阳性率4％.产生子一代阳性小鼠8只,子二代阳性小鼠5只,EPHA2突变转基因小鼠成功建系.取阳性小鼠及同组阴性小鼠眼球组织进行表型对比,可见阳性小鼠晶体组织全部浑浊,出现全白内障表型.提取阳性小鼠与同组阴性小鼠眼球组织蛋白,western blot检测EPHA2蛋白表达,发现阳性小鼠EPHA2蛋白表达明显低于阴性对照组,且蛋白分子量略增大.证实EPHA2基因内含子点突变能够形成异常剪切,导致终止密码子延迟111bp出现,进而产生较野生型蛋白增加37个氨基酸残基的全新突变蛋白.对转基因阳性小鼠及同组阴性对照小鼠眼球组织石蜡切片进行的HE染色及免疫组化显示,先天性白内障小鼠的晶体组织结构不完整,在晶体上皮细胞区域发现大小不等的空泡样结构.免疫组化结果显示,在先天性白内障表型小鼠晶体上皮细胞和晶体纤维细胞区域,六边形细胞结构被破坏,细胞排列无序,呈不规则形状.在突变型EPHA2受体蛋白中,与配体结合的细胞外结构域并未发生突变,形成小鼠晶体细胞病理改变的原因可能与SAM结构域突变后影响EHPA2蛋白对某些细胞连接蛋白,如N-cadherin等的募集作用及影响下游信号分子的活化有关,需进一步实验证实.结论 先天性白内障转基因模型鼠的成功建系证实,该EPHA2基因突变可以导致C57BL/6J小鼠先天性白内障的发生,并为进一步研究其致病分子机制打下坚实基础.
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