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摘 要：为了确定盐析法脱除玛卡多糖中的蛋白质的最佳工艺，以多糖回收率与蛋白质清除率为考察指标，在单因素试验基础上，通过响应面优化盐析法脱除玛卡多糖中蛋白质的工艺条件。结果表明，盐析法脱蛋白最佳工艺为硫酸铵浓度4%、转速290r/min、盐析时间19min。在此工艺条件下脱除玛卡多糖中的蛋白质，蛋白质的清除率为（35.63±0.94）%，与理论值35.82%相比，误差0.19%;多糖回收率为（88.25±0.86）%，与理论值88.69%相比，误差0.44%。回归方程与实际情况拟合较好，表明优化工艺可靠。
关键词：玛卡多糖;盐析;脱蛋白;响应面设计
中图分类号 R283 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）20-0127-05
Study on the Deproteinization Process by Salting out Method of Maca Polysaccharides from Yunnan
CHENG Tingting1# LI Yue1，2# et al.
（1College of Basic Medicine， Dali University， Dali 671000， China; 2Fuling Central Hospital of Chongqing City， Chongqing 408000， China）
Abstract： To determine the optimum process for removing protein from Maca polysaccharide by salting-out method. Based on the single factor experiment， the process conditions of removing protein from Maca polysaccharide by salting-out method were optimized by response surface methodology with the recovery rate of polysaccharide and the clearance rate of protein as the indexes. The results showed that the optimum process of deproteinization by salting-out method was ammonium sulfate concentration 4%， rotation speed 290r/min and salting-out time 19min. The removal rate of protein from Maca polysaccharide by this process was （35.63±0.94）% with an error of 0.19% compared with the theoretical value of 35.82%， and the recovery rate of polysaccharide was （88.25±0.86）% with an error of 0.44% compared with the theoretical value of 88.69%. The regression equation fits well with the actual situation， which shows that the optimized process is reliable.
Key words： Maca polysaccharides;Salting-out;Deproteinization;Response surface method
瑪卡（Lepidium meyenii Walp），西班牙语Maca，主产于拉丁美洲高原地区及中国云南迪庆、昭通等高寒地区，是一种十字花科植物[1-2]。目前研究显示玛卡中含有皂苷、蛋白质、多糖等多种成分，其中碳水化合物含量丰富[3]。长期食用具有改善性功能、抗疲劳、抗更年期综合症及抗癌等作用。
多糖作为一种天然产物，广泛存在于微生物、动植物等有机体内，具有抗炎、抗癌、调节免疫等多种生物学作用[4-6]。多糖提取过程中，常混杂大量的蛋白质，需对其进行分离纯化，否则会影响多糖的生物学活性及结构解析等。目前多糖脱蛋白常用的方法有盐酸法，Sevage法，TCA法，酶解法等。Sevage法作为经典脱蛋白方法，操作方便，但所用试剂均有毒，排放中会对人体造成危害及环境污染[7]。TCA法脱蛋白反应剧烈，虽除蛋白效率较好，但多糖损失也较大[8]。盐酸法脱蛋白反应需严格控制实验条件，否则易引起多糖水解，得不偿失[9]。酶解法脱蛋白具有条件温和、安全便捷、效率高等优点，但易带入外源性蛋白质，增加实验成本[10]。
盐析法是利用无机盐中和蛋白分子表面电荷，破坏蛋白表面水化膜，使蛋白变性而沉淀析出。相比传统脱蛋白方法，其多糖丢失少，不破坏多糖结构及活性，还具有环保、低毒、成本低、易获取等特点。因此本试验选取盐析法，以蛋白质清除率和多糖保留率为考察指标，响应面优化玛卡多糖（Maca polysaccharides，以下简称MCPC）脱蛋白最佳工艺，为云南玛卡多糖的分离纯化及生物学活性的研究提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 材料与试剂 迪庆玛卡粉末，为黄色粉末状，购于云南迪庆香格里拉县药材市场，由大理大学药学院姜北教授鉴定;D-无水葡萄糖（含量≥99%，批号110833-201506），中国食品药品检定研究院;考马斯亮蓝G250，上海化学试剂分装厂;其他试剂均为国产AR。 1.1.2 主要仪器 FST-Ⅲ-20普力菲尔超纯水机（上海富诗特仪器设备有限公司）;HJ-3恒温磁力搅拌器（常州智博瑞仪器制造有限公司）;SHA-C恒温水浴箱（金坛市杰瑞尔电器有限公司）;AG135电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）;RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚东生化仪器厂）;FD-1型冷冻干燥机（北京博医康技术有限公司）;754紫外可见光分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）;LD4-2A低速离心机（北京市医用离心机厂）等。
1.2 试验方法
1.2.1 MCPC制备 参照文献[11]的方法制得。
1.2.2 绘制葡萄糖标准曲线 参照文献[12]绘制葡萄糖标准曲线，纵坐标为吸光度值（A），横坐标为葡萄糖浓度（C），得回归方程为A=0.01625C-0.01447 （R2=0.999），线性范围为2.5～45.0?g/mL。
1.2.3 绘制牛血清白蛋白标准曲线 参照文献[13]绘制牛血清白蛋白标准曲线，纵坐标为吸光度值（A），横坐标为葡萄糖浓度（C），得回归方程为A=0.00489C-0.00693（R2=0.999），线性范围为0.01～0.08?g/mL。
1.2.4 盐析法脱蛋白单因素试验 取适量MCPC配制成1g/L多糖液，吸取10mL多份，固定其他因素不变，依次考虑硫酸铵浓度（2%、4%、6%、8%、10%）、转速（100、200、300、400、500、600r/min）、时间（10、20、30、40、50min）對MCPC蛋白清除率和多糖回收率的影响。
[多糖回收率（%）=C2C1×100]
[蛋白脱除率（%）=M1-M2M1×100]
式中：C1为脱蛋白或脱色前多糖的质量浓度;C2为脱蛋白或脱色后多糖的质量浓度;M1为脱蛋白前多糖溶液中蛋白质的质量浓度;M2为脱蛋白后多糖溶液中蛋白质的质量浓度。
1.2.5 响应面试验设计 以蛋白质清除率（Y1）和多糖回收率（Y2）为考察指标，在单因素试验的基础上，进行Box-Behnken响应面4因素3水平试验设计和数据处理，各因素及水平见表1。
1.2.6 验证工艺 取响应面试验优选的脱蛋白最适工艺，重复3次，测定蛋白清除率，以确定MCPC盐析法脱蛋白的最佳工艺。
1.3 数据处理 使用软件OriginPro9.1制图及单因素分析。采用软件Design-Expert 8.0.6对试验数据进行分析，确定脱蛋白最适工艺。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 硫酸铵浓度 固定转速400r/min，时间20min，考察2%、4%、6%、8%、10%硫酸铵浓度对MCPC蛋白清除率和多糖回收率的影响。由图1可知，随硫酸铵浓度升高，多糖回收率逐渐下降，当硫酸铵浓度为4%时蛋白质清除率达到最大。这是由于硫酸铵浓度较低时，蛋白质沉淀不完全，在一定的硫酸铵浓度范围内，蛋白清除率会随硫酸铵的浓度升高而增加。当硫酸铵浓度继续升高时，会生成蛋白酸铵，阻碍蛋白质的沉淀，且会加大脱盐的难度[14]。因此硫酸铵浓度选择4%。
2.1.2 搅拌转速 固定硫酸铵浓度4%，时间20min，考察100、200、300、400、500、600r/min转速对MCPC蛋白清除率和多糖回收率的影响。由图2可知，随着转速的增加，多糖回收率逐渐降低，当转速为300r/min时蛋白清除率最大。这可能是由于转速的增加利于蛋白沉淀，但转速过快又会使析出的蛋白溶解，影响蛋白清除率及多糖继续损失。因此转速选择300r/min。
2.1.3 盐析时间 固定硫酸铵浓度4%，转速300r/min，考察10、20、30、40、50min时间对MCPC蛋白清除率和多糖回收率的影响。由图3可知，随着时间的延长，多糖回收率逐渐降低，在时间为20min时蛋白清除率最大。这可能是由于盐析法时间较短，部分蛋白来不及析出，盐析效果不佳，蛋白清除率低;若搅拌时间过长，部分析出的蛋白会发生溶解，从而使蛋白清除率降低。因此选择时间为20min。
2.2 响应面试验
2.2.1 响应面试验设计 试验设计和结果见表2。
2.2.2 响应面模型建立及分析 蛋白质清除率（Y1）与硫酸铵浓度（A）、转速（B）、时间（C）的二元多项回归方程为Y1=35.752-0.52875A-0.8775B-0.61875C-0.1175AB-0.02AC+0.1425BC-1.426A2-4.8485B2-3.301C2。
表3为蛋白清除率回归模型方差分析结果。由表3可知，失拟项系数R2Adj值0.9942，表明99.42%的试验数据能用模型解释;相关系数R2值0.9975，表明该模型能很好地模拟实际情况，且误差小，能够很好地显示3个因素和响应值的关系;失拟项P值为0.6204（P>0.05），表明本试验中的二元多项回归方程极显著，具有统计学意义，对试验中的拟合较好。3因素对MCPC酶法脱蛋白的影响不呈线性关系。方差分析表明，响应面优化的模型p值<0.0001，提示3因素间有相应的交互效应，A、B、C、A2、B2、C2项对MCPC盐析法脱蛋白的影响极显著。且方差分析A、B、C因素的F值分别为34.33359、94.56113、47.01634，表明在试验条件下，各因素对MCPC盐析法脱蛋白的影响程度为转速（B）>时间（C）>硫酸铵浓度（A）。在交互效应下，3因素对MCPC盐析法脱蛋白的影响程度为BC>AB>AC。
多糖回收率（Y2）与硫酸铵浓度（A）、盐析转速（B）、盐析时间（C）的二元多项回归方程为Y2=88.222-3.035A-1.73625B-2.94875C-0.1775AB+0.1125AC+0.255BC-1.621A2+0.2265B2-0.5585C2。 表4为多糖回收率回归模型方差分析结果。由表4可知，失拟项系数R2Adj值0.9953，表明99.53%的试验数据能用模型解释;相关系数R2值0.9979，表明该模型能很好地模拟实际情况，且误差小，能够很好地显示3个因素和响应值的关系;失拟项P值为0.5327（P>0.05），表明本试验中的二元多项回归方程极显著，具有统计学意义，对试验中的拟合较好。3因素对MCPC酶法脱蛋白的影响不呈线性关系。方差分析表明，响应面优化的模型P值<0.0001，提示3因素间有相应的交互效应，A、B、C、A2、C2项对MCPC盐析法多糖回收率的影响极显著。且方差分析A、B、C因素的F值分别为1383.085、452.6433、1305.592，表明在试验条件下，各因素对MCPC盐析法多糖回收率的影响程度为硫酸铵浓度（A）>时间（C）>转速（B）。在交互效应下，3因素对MCPC盐析法多糖回收率的影响程度为AC>AB>BC。
2.2.3 响应面图分析 根据二次回归模型绘制各因素响应面及等高线（图4）。响应面曲面的平缓陡峭程度反映各因素变化时MCPC盐析法脱蛋白效率的响应灵敏度，曲面坡度陡峭，响应值敏感，曲面坡度平缓，响应值不敏感[15]。由图4可知，两两因素的响应面曲面较平缓，表明两两因素之间的交互效应均不显著，与模型分析结果一致。
2.3 验证试验 为确保蛋白去除过程中MCPC脱蛋白效率最佳，且多糖损失最小，据响应面优化分析得知盐析法脱蛋白最佳工艺为硫酸铵浓度3.64%、盐析转速291.05r/min、盐析时间19.04min。为利于操作，各因素修正为硫酸铵浓度4%、盐析转速290r/min、盐析时间19min，平行3组实验，得蛋白清除率为（35.63±0.94）%，与理论值35.82%相比，误差0.19%;多糖回收率为（88.25±0.86）%，与理论值88.69%相比，误差0.44%。这说明该模型能很好地模拟MCPC盐析法脱蛋白条件。
3 讨论
玛卡作为一种药食同源植物，原产于南美洲秘鲁，因其富含多种成分及保健功能，被当地人当作补药使用，称为“秘鲁人参”。1992年FAO组织提议把玛卡作为世界性重要营养食品大力进行推广与种植，我国云南[16]、新疆[17]等地区均有玛卡的引种栽培，因云南省的地理环境与原产地类似，其玛卡的引种最为成功。目前对玛卡中的有效成分研究较为彻底，其含有生物碱、多糖、芥子油苷、甾醇等。Tang W等[18]从玛卡中分离纯化出多糖成分MP，使用小鼠的重量加载的游泳模型，结果显示高剂量MP可显著降低血尿素氮、乳酸和丙二醛的水平（P<0.05），提示MP可能具有抗疲劳作用。W Jin等[19]研究发现玛卡中的苄基异硫氰酸酯可加速胃排空、肠推进及胃泌素的分泌，利于胃肠功能。
玛卡多糖是植物性多糖，在分离提取中多采用水作溶剂，因相似相溶原理，提取液中常会夹杂蛋白质、色素等，会影响多糖纯度及生物学活性研究等，常需脱色及脱蛋白处理[20]。王金全[21]比较了Sevage法和酶法对玛卡多糖脱蛋白效果，发现经0.1mg/L中性蛋白酶处理1h后，蛋白脱除率约为51%，多糖损失率达14%左右，除蛋白效果明显好于Sevage法。本研究采用盐析法对MCPC进行脱蛋白处理，在最适工艺（硫酸铵浓度4%、盐析转速290r/min、盐析时间19min）条件下，算得蛋白清除率为（35.63±0.94）%，多糖回收率为（88.25±0.86）%。相比王金全的酶法，虽然蛋白去除效果不足，但多糖回收率较好。另外，常用的Sevage法、TCA法等脱蛋白方法，在多糖纯化过程中，不仅有多糖的损失及试剂的安全隐患，还会破坏多糖的结构，不利于多糖后期活性的研究与开展。而本研究所采用的盐析法，不仅具有安全、便捷、低成本等特点，还在脱蛋白过程中完好地保留了多糖的原有结构，利于其生物学活性及结构的研究，可为MCPC的分离純化及生物学活性的研究提供参考。
参考文献
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关键词：玛卡多糖;盐析;脱蛋白;响应面设计
中图分类号 R283 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）20-0127-05
Study on the Deproteinization Process by Salting out Method of Maca Polysaccharides from Yunnan
CHENG Tingting1# LI Yue1，2# et al.
（1College of Basic Medicine， Dali University， Dali 671000， China; 2Fuling Central Hospital of Chongqing City， Chongqing 408000， China）
Abstract： To determine the optimum process for removing protein from Maca polysaccharide by salting-out method. Based on the single factor experiment， the process conditions of removing protein from Maca polysaccharide by salting-out method were optimized by response surface methodology with the recovery rate of polysaccharide and the clearance rate of protein as the indexes. The results showed that the optimum process of deproteinization by salting-out method was ammonium sulfate concentration 4%， rotation speed 290r/min and salting-out time 19min. The removal rate of protein from Maca polysaccharide by this process was （35.63±0.94）% with an error of 0.19% compared with the theoretical value of 35.82%， and the recovery rate of polysaccharide was （88.25±0.86）% with an error of 0.44% compared with the theoretical value of 88.69%. The regression equation fits well with the actual situation， which shows that the optimized process is reliable.
Key words： Maca polysaccharides;Salting-out;Deproteinization;Response surface method
瑪卡（Lepidium meyenii Walp），西班牙语Maca，主产于拉丁美洲高原地区及中国云南迪庆、昭通等高寒地区，是一种十字花科植物[1-2]。目前研究显示玛卡中含有皂苷、蛋白质、多糖等多种成分，其中碳水化合物含量丰富[3]。长期食用具有改善性功能、抗疲劳、抗更年期综合症及抗癌等作用。
多糖作为一种天然产物，广泛存在于微生物、动植物等有机体内，具有抗炎、抗癌、调节免疫等多种生物学作用[4-6]。多糖提取过程中，常混杂大量的蛋白质，需对其进行分离纯化，否则会影响多糖的生物学活性及结构解析等。目前多糖脱蛋白常用的方法有盐酸法，Sevage法，TCA法，酶解法等。Sevage法作为经典脱蛋白方法，操作方便，但所用试剂均有毒，排放中会对人体造成危害及环境污染[7]。TCA法脱蛋白反应剧烈，虽除蛋白效率较好，但多糖损失也较大[8]。盐酸法脱蛋白反应需严格控制实验条件，否则易引起多糖水解，得不偿失[9]。酶解法脱蛋白具有条件温和、安全便捷、效率高等优点，但易带入外源性蛋白质，增加实验成本[10]。
盐析法是利用无机盐中和蛋白分子表面电荷，破坏蛋白表面水化膜，使蛋白变性而沉淀析出。相比传统脱蛋白方法，其多糖丢失少，不破坏多糖结构及活性，还具有环保、低毒、成本低、易获取等特点。因此本试验选取盐析法，以蛋白质清除率和多糖保留率为考察指标，响应面优化玛卡多糖（Maca polysaccharides，以下简称MCPC）脱蛋白最佳工艺，为云南玛卡多糖的分离纯化及生物学活性的研究提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 材料与试剂 迪庆玛卡粉末，为黄色粉末状，购于云南迪庆香格里拉县药材市场，由大理大学药学院姜北教授鉴定;D-无水葡萄糖（含量≥99%，批号110833-201506），中国食品药品检定研究院;考马斯亮蓝G250，上海化学试剂分装厂;其他试剂均为国产AR。 1.1.2 主要仪器 FST-Ⅲ-20普力菲尔超纯水机（上海富诗特仪器设备有限公司）;HJ-3恒温磁力搅拌器（常州智博瑞仪器制造有限公司）;SHA-C恒温水浴箱（金坛市杰瑞尔电器有限公司）;AG135电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）;RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚东生化仪器厂）;FD-1型冷冻干燥机（北京博医康技术有限公司）;754紫外可见光分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）;LD4-2A低速离心机（北京市医用离心机厂）等。
1.2 试验方法
1.2.1 MCPC制备 参照文献[11]的方法制得。
1.2.2 绘制葡萄糖标准曲线 参照文献[12]绘制葡萄糖标准曲线，纵坐标为吸光度值（A），横坐标为葡萄糖浓度（C），得回归方程为A=0.01625C-0.01447 （R2=0.999），线性范围为2.5～45.0?g/mL。
1.2.3 绘制牛血清白蛋白标准曲线 参照文献[13]绘制牛血清白蛋白标准曲线，纵坐标为吸光度值（A），横坐标为葡萄糖浓度（C），得回归方程为A=0.00489C-0.00693（R2=0.999），线性范围为0.01～0.08?g/mL。
1.2.4 盐析法脱蛋白单因素试验 取适量MCPC配制成1g/L多糖液，吸取10mL多份，固定其他因素不变，依次考虑硫酸铵浓度（2%、4%、6%、8%、10%）、转速（100、200、300、400、500、600r/min）、时间（10、20、30、40、50min）對MCPC蛋白清除率和多糖回收率的影响。
[多糖回收率（%）=C2C1×100]
[蛋白脱除率（%）=M1-M2M1×100]
式中：C1为脱蛋白或脱色前多糖的质量浓度;C2为脱蛋白或脱色后多糖的质量浓度;M1为脱蛋白前多糖溶液中蛋白质的质量浓度;M2为脱蛋白后多糖溶液中蛋白质的质量浓度。
1.2.5 响应面试验设计 以蛋白质清除率（Y1）和多糖回收率（Y2）为考察指标，在单因素试验的基础上，进行Box-Behnken响应面4因素3水平试验设计和数据处理，各因素及水平见表1。
1.2.6 验证工艺 取响应面试验优选的脱蛋白最适工艺，重复3次，测定蛋白清除率，以确定MCPC盐析法脱蛋白的最佳工艺。
1.3 数据处理 使用软件OriginPro9.1制图及单因素分析。采用软件Design-Expert 8.0.6对试验数据进行分析，确定脱蛋白最适工艺。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 硫酸铵浓度 固定转速400r/min，时间20min，考察2%、4%、6%、8%、10%硫酸铵浓度对MCPC蛋白清除率和多糖回收率的影响。由图1可知，随硫酸铵浓度升高，多糖回收率逐渐下降，当硫酸铵浓度为4%时蛋白质清除率达到最大。这是由于硫酸铵浓度较低时，蛋白质沉淀不完全，在一定的硫酸铵浓度范围内，蛋白清除率会随硫酸铵的浓度升高而增加。当硫酸铵浓度继续升高时，会生成蛋白酸铵，阻碍蛋白质的沉淀，且会加大脱盐的难度[14]。因此硫酸铵浓度选择4%。
2.1.2 搅拌转速 固定硫酸铵浓度4%，时间20min，考察100、200、300、400、500、600r/min转速对MCPC蛋白清除率和多糖回收率的影响。由图2可知，随着转速的增加，多糖回收率逐渐降低，当转速为300r/min时蛋白清除率最大。这可能是由于转速的增加利于蛋白沉淀，但转速过快又会使析出的蛋白溶解，影响蛋白清除率及多糖继续损失。因此转速选择300r/min。
2.1.3 盐析时间 固定硫酸铵浓度4%，转速300r/min，考察10、20、30、40、50min时间对MCPC蛋白清除率和多糖回收率的影响。由图3可知，随着时间的延长，多糖回收率逐渐降低，在时间为20min时蛋白清除率最大。这可能是由于盐析法时间较短，部分蛋白来不及析出，盐析效果不佳，蛋白清除率低;若搅拌时间过长，部分析出的蛋白会发生溶解，从而使蛋白清除率降低。因此选择时间为20min。
2.2 响应面试验
2.2.1 响应面试验设计 试验设计和结果见表2。
2.2.2 响应面模型建立及分析 蛋白质清除率（Y1）与硫酸铵浓度（A）、转速（B）、时间（C）的二元多项回归方程为Y1=35.752-0.52875A-0.8775B-0.61875C-0.1175AB-0.02AC+0.1425BC-1.426A2-4.8485B2-3.301C2。
表3为蛋白清除率回归模型方差分析结果。由表3可知，失拟项系数R2Adj值0.9942，表明99.42%的试验数据能用模型解释;相关系数R2值0.9975，表明该模型能很好地模拟实际情况，且误差小，能够很好地显示3个因素和响应值的关系;失拟项P值为0.6204（P>0.05），表明本试验中的二元多项回归方程极显著，具有统计学意义，对试验中的拟合较好。3因素对MCPC酶法脱蛋白的影响不呈线性关系。方差分析表明，响应面优化的模型p值<0.0001，提示3因素间有相应的交互效应，A、B、C、A2、B2、C2项对MCPC盐析法脱蛋白的影响极显著。且方差分析A、B、C因素的F值分别为34.33359、94.56113、47.01634，表明在试验条件下，各因素对MCPC盐析法脱蛋白的影响程度为转速（B）>时间（C）>硫酸铵浓度（A）。在交互效应下，3因素对MCPC盐析法脱蛋白的影响程度为BC>AB>AC。
多糖回收率（Y2）与硫酸铵浓度（A）、盐析转速（B）、盐析时间（C）的二元多项回归方程为Y2=88.222-3.035A-1.73625B-2.94875C-0.1775AB+0.1125AC+0.255BC-1.621A2+0.2265B2-0.5585C2。 表4为多糖回收率回归模型方差分析结果。由表4可知，失拟项系数R2Adj值0.9953，表明99.53%的试验数据能用模型解释;相关系数R2值0.9979，表明该模型能很好地模拟实际情况，且误差小，能够很好地显示3个因素和响应值的关系;失拟项P值为0.5327（P>0.05），表明本试验中的二元多项回归方程极显著，具有统计学意义，对试验中的拟合较好。3因素对MCPC酶法脱蛋白的影响不呈线性关系。方差分析表明，响应面优化的模型P值<0.0001，提示3因素间有相应的交互效应，A、B、C、A2、C2项对MCPC盐析法多糖回收率的影响极显著。且方差分析A、B、C因素的F值分别为1383.085、452.6433、1305.592，表明在试验条件下，各因素对MCPC盐析法多糖回收率的影响程度为硫酸铵浓度（A）>时间（C）>转速（B）。在交互效应下，3因素对MCPC盐析法多糖回收率的影响程度为AC>AB>BC。
2.2.3 响应面图分析 根据二次回归模型绘制各因素响应面及等高线（图4）。响应面曲面的平缓陡峭程度反映各因素变化时MCPC盐析法脱蛋白效率的响应灵敏度，曲面坡度陡峭，响应值敏感，曲面坡度平缓，响应值不敏感[15]。由图4可知，两两因素的响应面曲面较平缓，表明两两因素之间的交互效应均不显著，与模型分析结果一致。
2.3 验证试验 为确保蛋白去除过程中MCPC脱蛋白效率最佳，且多糖损失最小，据响应面优化分析得知盐析法脱蛋白最佳工艺为硫酸铵浓度3.64%、盐析转速291.05r/min、盐析时间19.04min。为利于操作，各因素修正为硫酸铵浓度4%、盐析转速290r/min、盐析时间19min，平行3组实验，得蛋白清除率为（35.63±0.94）%，与理论值35.82%相比，误差0.19%;多糖回收率为（88.25±0.86）%，与理论值88.69%相比，误差0.44%。这说明该模型能很好地模拟MCPC盐析法脱蛋白条件。
3 讨论
玛卡作为一种药食同源植物，原产于南美洲秘鲁，因其富含多种成分及保健功能，被当地人当作补药使用，称为“秘鲁人参”。1992年FAO组织提议把玛卡作为世界性重要营养食品大力进行推广与种植，我国云南[16]、新疆[17]等地区均有玛卡的引种栽培，因云南省的地理环境与原产地类似，其玛卡的引种最为成功。目前对玛卡中的有效成分研究较为彻底，其含有生物碱、多糖、芥子油苷、甾醇等。Tang W等[18]从玛卡中分离纯化出多糖成分MP，使用小鼠的重量加载的游泳模型，结果显示高剂量MP可显著降低血尿素氮、乳酸和丙二醛的水平（P<0.05），提示MP可能具有抗疲劳作用。W Jin等[19]研究发现玛卡中的苄基异硫氰酸酯可加速胃排空、肠推进及胃泌素的分泌，利于胃肠功能。
玛卡多糖是植物性多糖，在分离提取中多采用水作溶剂，因相似相溶原理，提取液中常会夹杂蛋白质、色素等，会影响多糖纯度及生物学活性研究等，常需脱色及脱蛋白处理[20]。王金全[21]比较了Sevage法和酶法对玛卡多糖脱蛋白效果，发现经0.1mg/L中性蛋白酶处理1h后，蛋白脱除率约为51%，多糖损失率达14%左右，除蛋白效果明显好于Sevage法。本研究采用盐析法对MCPC进行脱蛋白处理，在最适工艺（硫酸铵浓度4%、盐析转速290r/min、盐析时间19min）条件下，算得蛋白清除率为（35.63±0.94）%，多糖回收率为（88.25±0.86）%。相比王金全的酶法，虽然蛋白去除效果不足，但多糖回收率较好。另外，常用的Sevage法、TCA法等脱蛋白方法，在多糖纯化过程中，不仅有多糖的损失及试剂的安全隐患，还会破坏多糖的结构，不利于多糖后期活性的研究与开展。而本研究所采用的盐析法，不仅具有安全、便捷、低成本等特点，还在脱蛋白过程中完好地保留了多糖的原有结构，利于其生物学活性及结构的研究，可为MCPC的分离純化及生物学活性的研究提供参考。
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