【摘 要】
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旨在获得MRC1基因修饰的PCV2靶细胞并在体外验证该细胞对PCV2的抑制作用，为后续基因编辑猪的生产提供理论基础。本研究1)首先利用基因工程技术建立了慢病毒介导的高效同源重组载体和CRISPR/Cas9基因靶向系统；2)通过细胞和分子生物学技术筛选了定点整合表达MRC1的PK15细胞系；3)随后通过细胞试验和PCV2的攻毒试验对其抗PCV2的作用进行了相关验证。结果：1)成功构建了含有红色荧光标
【机 构】
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山东农业大学动物科技学院山东省动物生物工程和疾病控制重点实验室
【基金项目】
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山东省农业良种工程（2019LZGC019）； 山东省重点研发项目（2019GNC106055）；
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旨在获得MRC1基因修饰的PCV2靶细胞并在体外验证该细胞对PCV2的抑制作用，为后续基因编辑猪的生产提供理论基础。本研究1)首先利用基因工程技术建立了慢病毒介导的高效同源重组载体和CRISPR/Cas9基因靶向系统；2)通过细胞和分子生物学技术筛选了定点整合表达MRC1的PK15细胞系；3)随后通过细胞试验和PCV2的攻毒试验对其抗PCV2的作用进行了相关验证。结果：1)成功构建了含有红色荧光标记基因、嘌呤霉素标记基因、同向LoxP序列和多克隆位点的pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP载体，同时根据不同猪品种间MRC1基因启动子差异序列设计同源臂，成功构建同源重组载体和靶向同源臂的CRISPR/Cas 9基因靶向载体；2)通过病毒包装和共转染的方法，利用嘌呤霉素筛选并验证了MRC1启动子基因编辑的PK15细胞株，成功将MRC1基因转录起始位点上游多出的14 bp敲入到PK15细胞中；3)随后对基因编辑的PK15细胞系进行了抗病毒验证，MRC1基因编辑的PK15细胞株MRC1的蛋白表达量显著增高（P＜0.05），同时显著降低了PCV2的复制（P＜0.05）。MRC1启动子编辑的PK15细胞中MRC1蛋白表达量显著增高，该位点可以用于抗PCV2猪的制备。
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