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基因组编辑是利用序列特异核酸酶在基因组特定位点产生DNA双链断裂,激活细胞自身的修复机制(非同源末端连接或同源重组),实现基因敲除、染色体重组以及基因定点插入或替换的技术。当有外源DNA或者病毒入侵,CRISPR/Cas系统会将入侵的序列片段整合进去,由特定的crRNA进行同源序列的降解。该系统构建简单、精准度高、成本低、能同时对多个位点进行定点编辑。本研究探索了利用豌豆早褐病毒介导CRISPR/Cas9系统的关键因子crRNA和Cas9蛋白在烟草中表达,期望实现对烟草基因进行编辑。主要结果如下:1、设计烟草PDS基因的目标编辑序列,设计引物扩增,酶切,与酶切后的pCAPE2-GFP连接获得pCAPE2:crRNA载体。利用农杆菌转化的方法获得遍在表达Cas9蛋白的转基因系。将pCAPE1和pCAPE2:crRNA质粒转化农杆菌GV3101,把包含pCAPE1和pCAPE2:Cas9-crRNA质粒的农杆菌1:1混合后侵染遍在表达Cas9蛋白的转基因系,但未能发现基因组编辑表型。2、获得烟草的crRNA序列。通过扩增得到Cas9片段,将载体和两个片段各自酶切,通过T4连接酶对该三片段进行连接,获得pCAPE2:Cas9-crRNA载体。将pCAPE1和pCAPE2:Cas9-crRNA,分别转化农杆菌GV3101,把包含pCAPE1和pCAPE2:Cas9-crRNA质粒的农杆菌1:1混合后侵染烟草品种Samsun。注射后2-3周,在烟草的新生叶片上出现了板块化的失绿,说明整合了Cas9和crRNA片段的pCAPE1和pCAPE2能够侵染烟草,并能实现扩增。对失绿的烟草叶片区域取样后,提取基因组DNA,设计特异引物扩增烟草PDS基因区域,扩增后的片段连接到pGEM-Teasy载体,通过对基因组测序后发现,PDS基因未能发生编辑。分析后发现所用的烟草品种Samsun的PDS基因与所设计的CRISPR/cas9系统的Target序列有几个碱基的差异。3、获取烟草的配子特异表达基因NtDMC1,将其构建进表达载体中,利用Gateway技术将Cas9蛋白构建到该载体中,获得pH7WG:NtDMC1:Cas9载体。论文构建PEBV介导的CRISPR/Cas9基因组编辑的载体pCAPE2:Cas9-crRNA和PEBV介导的crRNA表达的载体pCAPE2:crRNA,获得了遍在表达Cas9蛋白的烟草转基因系,克隆烟草配子特异表达基因NtDMC1的启动子,构建了Cas9配子特异表达载体pH7WG:NtDMC1:Cas9,证明了PEBV能够介导crRNA和Cas9蛋白能在烟草中扩增,为RNA病毒介导CRISPR/Cas9系统在植物基因组编辑中的应用打下良好基础。